Gear Aid — комплексный уход за экипировкой

И вот ты достал свою любимую горнолыжную куртку из темного шкафа и обнаружил, что прошлый сезон она пережила с трудом: мембрана заметно поистерлась, а карман украшает дыра величиной с палец. Рассказываем, как при помощи пропиток и заплаток Gear Aid привести все в порядок.

Что такое мембранная ткань
Мембранный материал — это технологичная ткань, которая не промокает от воды снаружи, но пропускает влажный воздух изнутри. Как говорит мама, “тело должно дышать”.
Работает это все за счет многослойной структуры, по принципу воронки.

Внешний слой защищает от ветра, сердцевина “отражает” воду, а подкладка отводит пар. Пока мембраны защищают нас, им тоже нужна защита. Для усиления свойств высокотехнологичных тканей, их обрабатывают водоотталкивающими пропитками (DWR) сразу на производстве. На поверхности вода даже не задерживается, а скатывается шариками.  Из водонепроницаемых они становятся водоотталкивающими

Со временем покрытие стирается и пачкается. Может сложится впечатление, что мембрана перестала выполнять свою функцию. Во влажную погоду внешний слой намокает и не позволяет пару изнутри свободно просачиваться сквозь ткань. Куртка становится тяжелой от влаги, вы начинаете потеть. Не спешите выбрасывать любимую вещь. Ей можно помочь: постирать и восстановить пропитку

Уход за мембаной
Стирать мембраны нужно подходящими средствами. Агрессивные ПАВы могут разрушить всю магию. Важно удалить из лотка остатки других моющих средств.
Большинству вещей подойдет режим “Синтетика”, либо “деликатная стирка” или специальный режим “спортивная одежда”, главное, чтобы не больше 40°C. На всякий случай, рекомендуем ознакомиться с инструкцией на конкретной вещи. Ставить высокие обороты не лучшая идея, да и бесполезно это. Обычная стиральная машина не может полноценно отжать мембрану как раз из-за ее свойств. Как вариант — можно попробовать средство для стирки GEAR AID REVIVEX DOWN CLEANER. Оно разработано для ухода за экипировкой и одеждой с различными технологиями, включая утеплители и водоотталкивающие пропитки, поэтому не содержит химикатов, способных навредить ткани. Мерный стаканчик прилагается

После удаления загрязнений можно заняться восстановлением DWR покрытия вашей куртки, комбеза или брюк. Сушить их перед обработкой не обязательно. Просто дайте стечь воде. Наносить лучше на открытом воздухе. Места, подверженные износу (рукава, колени, и т.д), обработайте более обильно. Сушить при комнатной температуре 48 часов.

Водоотталкивающая пропитка GEAR AID REVIVEX DURABLE WATER REPELLENT подходит даже для изделий Gore-Tex, eVent, NeoShell, при том – не нарушая дышащие способности материалов. Защищает не только от  воды и грязи, но даже от масла. Одного баллончика обычно достаточно для обработки 4-х курток.

На фото — старая куртка Burton. Левую сторону мы Не обрабатывали Gear Aid…

а  на правую нанесли аэрозоль. Ради справедливости стоит отметить, что предварительно куртку мы не стирали (а надо бы было).

Средства для пропитки текстиля в домашних условиях рассчитаны на взаимодействие с промышленно нанесённым DWR. Поэтому не стоит затягивать с обработкой — большая часть фабричного покрытия просто сотрётся и его восстановление станет невозможным.

Защита обуви
Обувные полки заполнены кроссовками, пока брогги и лодочки пылятся на антресолях. Чтобы вслед за ними туда не отправились на целый сезон любимые замшевые кроссовки или белые кеды, рекомендуем, обработать их водоотталкивающей пропиткой GEAR AID REVIVEX SUEDE + FABRIC WATER REPELLENT

Средство подойдет для любой замшевой и текстильной обуви, даже с технологией Gore-Tex, надежно защищая от воды, грязи и масла, при том – не нарушая дышащие способности материалов. Этой бутылочки хватит надолго, поэтому Вы сможете обработать всю свою обувь и быть спокойным за ее износостойкость, особенно в мокрую погоду.

Извините, за неприглядный вид пары.

Волшебство?

Антифог
Раз уж мы заговорили о погоде, пригодится также и антифог. Давайте не будем уподобляться суровым дайверам, плюющим в собственные маски. Да и не эстетично это. Спрей против запотевания GEAR AID ANTIFOG SPRAY — другое дело.

Побрызгал — и пошел. Его можно наносить на любой тип линз. Если вы носите очки для коррекции зрения, их тоже можно брызнуть. А потом спокойно заходить с улицы в помещение и не чувствовать себя “ежиком в тумане”.

Уход за гидрокостюмами и снаряжением для дайверов
Новинка в нашем арсенале — средство для обработки швов GEAR AID SILICONE LUBRICANT. Средство пригодится не только им.Можно, например, обрабатывать им канты борда и лезвия коньков перед хранением. Высококачественный силикон — штука универсальная. Но а работу по прямому назначения — защищать экип от соленой воды, грязи и разрушения — выполняет на 5+.

Патчи
Классная штука, которую хорошо иметь всегда с собой — патчи. И я сейчас не о ваших наклейках под глазами. В 1981 году Gear Aid начали с ремонта оборудования для дайвинга, основатели направляли линейку товаров на уход за водной экипировкой. И в этом они профи. Набор заплаток GEAR AID TENACIOUS TAPE PATCHES OUTDOORS

Спасут ваши вещи и поднимут настроение. Подходят для ремонта любых текстильных изделий. Патч просто наклеивается на место с дефектом и предотвращает дальнейшую порчу. Вещи можно даже стирать. Не оставляет никаких следов после снятия.

Ссылочка на полный каталог Gear Aid https://www.traektoria.ru/brand/gear_aid/
Катайтесь аккуратно и с удовольствием!

Какое средство для стирки мембранной одежды выбрать?

Одежда из мембранных тканей произвела фурор на рынке благодаря своей практичности. Каждому понравятся легкие и удобные наряды, которые уберегут своего владельца от влаги и ветра, и при этом позволят телу дышать. Вещи из подобных материалов прослужат не менее пяти лет. Но это возможно лишь при условии, что будет использоваться специальное средство для стирки мембранной одежды, не наносящее вред деликатным материалам.

Почему требуется надлежащий уход?

Мембранные ткани отличаются особым строением, благодаря которому они имеют ряд преимуществ:

• отталкивают влагу;
• выпускают испарения изнутри;
• не продуваются ветром;
• не сминаются;
• мало весят.

Материал состоит из нескольких слоев, главным из которых является мембранная сетка. Она имеет микроскопические поры, выводящие влагу изнутри. Ткань обрабатывается специальными пропитками, которые предотвращают проникновение воды и воздуха снаружи.

Неправильная стирка с использованием обычных порошков испортит свойства мембранных тканей, поэтому применять для чистки одежды нужно специально разработанные средства.

Какими средствами стирают мембранные вещи?

Наряду с высокотехнологическими тканями, на рынке появились специальные средства, предназначенные для деликатной стирки. Они бережно, но эффективно устраняют загрязнения, не повреждая при этом мембранную сетку.

Производители чистящих средств, следящие за потребностями покупателей, разработали специальные гели, которые обеспечивают должный уход за термоодеждой.

1. Компания Henkel выпускает гель Perwoll Sport & Active. Средство обеспечивает должный уход за функциональными тканями и придает вещам приятный запах.
2. Бренд Domal производит гель Domal Sport Fein Fashion с активной формулой, который бережно очищает спортивную одежду, устраняя неприятные запахи и сохраняя свойства деликатных тканей.
3. Производитель Nikwax предложил потребителям жидкое средство Nikwax Tech Wash 5l для стирки спортивной одежды из дышащих материалов. Гель в неразбавленном виде используется как пятновыводитель. Он устраняет даже застарелые загрязнения, не повреждая функции водоотталкивающих материалов.
4. Не осталась в стороне компания Denkmit. На рынке можно приобрести жидкий стиральный порошок Denkmit Fresh Sensation, представленный брендом. Средство устраняет застарелые пятна и въевшиеся неприятные запахи.

Это некоторые из веществ, рекомендованные для стирки мембранной одежды.

Чем нельзя стирать термоодежду?

Чтобы дышащие ткани не утратили свои свойства, их нельзя стирать веществами, содержащими хлор. Этот элемент повредит поры мембраны, и вещи утратят свои водоотталкивающие функции. Не рекомендуется использовать сухой гранулированный стиральный порошок. Его мельчайшие частицы забьют сетку, и вентиляционные способности одежды будут утрачены.

При отсутствии специальных гелей можно стирать термоодежду хозяйственным мылом. Это должны быть единичные случаи, поскольку частички мыла могут накапливаться в порах сетки.

Видео обзор средств:

Как проводить стирку?

Вещи из мембранных тканей производители рекомендуют стирать вручную. Температура воды, используемой для стирки, должна быть в пределах от 30 до 40 градусов. В ней разбавляют используемое для стирки средство. Сильнозагрязненные вещи можно замачивать максимум на 20 минут. Пятна оттирают мягкими щетками, нанося на них неразбавленное средство.

Подержав одежду в мыльном растворе, ее нужно тщательно прополоскать в прохладной воде. После этого вещь несильно сдавливают и раскладывают на горизонтальной поверхности, где она должна находиться до полного высыхания. Можно обернуть ее полотенцем, которое впитает излишнюю влагу.

Сушить вещи рекомендуется в хорошо проветриваемых помещениях, не допуская попадания на них прямых солнечных лучей.

Применяется и автоматическая стирка мембранной одежды:

• вещь помещается в машинку;
• подбирается наиболее щадящая программа;
• выключается отжим;
• сушка одежды проводится по аналогичной схеме, как при ручной стирке.

Нельзя утюжить вещи из мембранных тканей. Высокая температура повредит нанесенную на материал пропитку, и защитные способности одежды будут утрачены.

Видеообзор средства Toko:

Уход после стирки

Мембранные ткани обрабатывают специальными пропитками, которые делают одежду водонепроницаемой. Во время стирки защитные средства понемногу смываются с материалов. Чтобы сохранить функции одежды, ее необходимо обрабатывать специальными пропитками, которые можно приобрести в специализированных магазинах. Вещи обрабатывается подобными аэрозолями только после полного высыхания.

Как стирать мембранную одежду? | Cleanipedia

Одно из новейших достижений текстильной промышленности, мембранная ткань состоит из синтетических волокон, покрытых тончайшим пористым слоем полимерной пленки. Изготовленная из такой ткани одежда отлично защищает от холода, ветра и влаги и обладает “дышащими” свойствами, позволяя поту легко испаряться и защищая организм от переохлаждения и перегрева.

Благодаря этим свойствам, мембранная одежда пользуется спросом среди любителей спорта и активного образа жизни. Куртки, плащи, штаны и перчатки из мембранной ткани отлично защищают от непогоды, однако, при регулярной носке, верхняя одежда нуждается в чистке несколько раз в сезон. Как стирать мембранные вещи и выбрать средства для стирки мембранных тканей? Обо всем по порядку.

Одежда из мембранной ткани может противостоять ливням и стуже, а вот неправильный уход может легко ее повредить. Прежде чем приступить к стирке мембранной одежды, внимательно ознакомьтесь с инструкциями по уходу на этикетках ваших изделий.

Как стирать мембранную одежду?

Прежде всего, ознакомьтесь с инструкциями по уходу на этикетках ваших изделий. Так вы узнаете, подходит ли ваша одежда для машинной стирки или ее необходимо чистить вручную.

Одежда из мембранной ткани может противостоять ливням и стуже, а вот неправильный уход может легко ее повредить, поэтому важно соблюдать несколько простых правил:

• Мембранная одежда не любит долгого контакта с водой, поэтому ее не стоит замачивать

• Будьте осторожны – отжим и сушка в стиральной машине, а также слишком грубая ручная стирка могут повредить ткань! После стирки, осторожно промокните изделие махровым полотенцем и развесьте на просушку вдали от отопительных приборов и избегая попадания прямых солнечных лучей

Как стирать мембранную куртку в стиральной машине?

Мини-опрос

Появились ли за время режима самоизоляции новые типы зягрязнений/пятен на Вашей одежде?

Да, пришлось столкнуться с новыми типами пятен

0%

Новых типов пятен было немного

0%

Нет, новых типов пятен не было

0%

0 Голос (-ов)

Не знаете, как стирать детскую мембранную одежду, а также куртки, штаны и перчатки с водооталкиваюшим покрытием? Машинная стирка может легко повредить изделие из мембранной ткани. Даже если этот метод чистки не противопоказан производителями, стирать мембранную одежду в стиральной машине нужно крайне осторожно:

• Стирайте крупную верхнюю одежду по отдельности, а мелкие вещи, например перчатки – вместе.

• Выверните куртку наизнанку, застегните все молнии и липучки и убедитесь, что в карманах не осталось мусора. Если на одежде имеются элементы из меха, их необходимо отстегнуть или плотно обернуть в целлофановый пакет.

• Выберите наиболее щадящую программу стирки.

• Убедитесь, что температура воды не превышает 40°C, а функции отжима и сушки отключены.

Ручная стирка мембранной одежды

Многие специалисты рекомендуют стирать одежду из мембранной ткани вручную. Вот как это правильно сделать:

1. Добавьте моющее средство в таз с теплой водой.

2. Намочите одежду, но не держите ее в тазу на протяжении всей стирки.

3. Осторожно обработайте всю поверхность куртки мыльной водой, но не трите слишком сильно.

4. Если вы заметили пятна или локальные загрязнения, их можно потереть мягкой губкой.

5. Тщательно прополощите изделие под проточной водой.

Как выбрать средства для стирки мембранных тканей?

Внимание! При стирке мембранных одежды, не стоит использовать стиральные порошки, пятновыводители, хлорные отбеливатели и кондиционеры для белья, так как они могут повредить ткань. Отдайте предпочтение жидкому средству для стирки без хлора или используйте обычное хозяйственное мыло.

Прежде чем приступить к стирке, внимательно ознакомьтесь с инструкциями на этикетка выбранного вами средства и протестируйте его воздействие на небольшом участке поверхности.

Покончив со стиркой, тщательно просушите мембранную одежду. При желании, чистые вещи можно обработать специальным защитным спреем содержащим фтор (его можно приобрести в большинстве хозяйственных магазинов). Такое средство не только усилит водоотталкивающие свойства ткани, но и защитит материал от грязи и негативного воздействия солнечных лучей.

Храните мембранную одежду в расправленном виде в вертикальном положении, защитив ее от пыли и грязи специальным чехлом или полиэтиленовой пленкой. При правильном уходе и регулярной чистке, одежда из мембранной ткани долгие годы прослужит вам верой и правдой.

• Мембранная одежда не любит долгого контакта с водой, поэтому ее не стоит замачивать.

• Отжим и сушка в стиральной машине, а также слишком грубая ручная работа могут повредить ткань.

• Стирайте крупную верхнюю одежду по отдельности, а мелкие вещи, например перчатки – вместе.

• Выберите наиболее щадящую программу стирки и убедитесь, что температура воды не превышает 40°C, а функции отжима и сушки отключены.

• Используйте жидкое средство для стирки без хлора и избегайте стиральные порошки, пятновыводители, хлорные отбеливатели и кондиционеры для белья.

• После стирки обработайте вещи специальным защитным спреем, содержащим фтор.

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

svetlana, 04. 06.2014 21:58

Оценка товара: (5 из 5)

Средство, очень хорошее. Но дороговато

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Евгений, 29.10.2014 21:15

Оценка товара: (5 из 5)

Запах от термобелья жуткий. Как когда-то сода пахла

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Евгения, 22.10.2015 08:46

Оценка товара: (5 из 5)

Добрый день! Какой объём у средства?
Мне необходимо средство для детского комбинезона и шапки, взрослой куртки фирмы дидриксонс. Подойдёт?
При какой температуре и оборотах необходимо стирать такие вещи?
Заранее благодарю вас за ответ

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Анна, 13.02.2017 22:02

Оценка товара: (4 из 5)

Та норм средство) сравнивать не с чем, т.к. первый раз купила. Постирала, никаких разводов и запаха неприятного нет. Я стирала куртку и штаны в стиралке на деликатном режиме с минимальным отжимом. Потом залила еще пропитку для водонепроницаемости и поставила на полоскание. Вроде норм. Какая была одежда, такая и осталась.

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Владислав, 22.04.2017 16:58

Оценка товара: (5 из 5)

Пользуюсь всегда,все что надо отстирает. Желательно после стирки сразу и пропитку сделать для лучшего результата.

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Михаил, 29.03.2020 22:52

Оценка товара: (5 из 5)

Подскажите, подойдёт ли данное средство для стирки Коламбия омни хит? Интересует именно подкладка. Спасибо

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Кирилл, 12.11.2020 10:19

Оценка товара: (5 из 5)

Добрый день, подойдет ли данное средство для мембран TEXAPORE.

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Ольга, 27. 12.2020 17:16

Оценка товара: (5 из 5)

Очень хорошее средство! И спасибо за быструю доставку!

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

Средство для стирки мембран Nikwax Tech wash

Юлия, 25.08.2021 11:05

Оценка товара: (5 из 5)

Добрый день! Какой объём средства рассчитан для 1 стирки, достаточно 100мл?

Был ли отзыв полезным? Да | Нет

детергентов для лизиса клеток и экстракции белков | Thermo Fisher Scientific

Детергенты — это класс молекул, уникальные свойства которых позволяют манипулировать (нарушать или формировать) гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями между молекулами в биологических образцах. В биологических исследованиях детергенты используются для лизиса клеток (высвобождения растворимых белков), солюбилизации мембранных белков и липидов, контроля кристаллизации белков, предотвращения неспецифического связывания в процедурах аффинной очистки и иммуноанализа, а также используются в качестве добавок при электрофорезе.

---

Свойства и виды моющих средств

Состав ПАВ. Обобщенная структура отдельной молекулы детергента (вверху) и полная структура CHAPS (внизу), пример цвиттерионного детергента.

Химическое определение моющего средства

Моющие средства представляют собой амфипатические молекулы, что означает, что они содержат как неполярный «хвост», имеющий алифатический или ароматический характер, так и полярную «голову». Ионный характер группы полярных голов лежит в основе широкой классификации моющих средств; они могут быть ионными (заряженными, анионными или катионными), неионными (незаряженными) или цвиттерионными (имеющими как положительно, так и отрицательно заряженные группы, но с нулевым суммарным зарядом).

---

Подобно компонентам биологических мембран, детергенты обладают гидрофобно-связывающими свойствами в результате их неполярных хвостовых групп. Тем не менее, моющие средства сами по себе растворимы в воде. Следовательно, молекулы детергента позволяют диспергировать (смешивать) нерастворимые в воде гидрофобные соединения в водной среде, включая экстракцию и солюбилизацию мембранных белков.

Детергенты при низкой концентрации в водном растворе образуют монослой на границе раздела воздух – жидкость.При более высоких концентрациях мономеры детергента объединяются в структуры, называемые мицеллами. Мицелла представляет собой термодинамически стабильный коллоидный агрегат мономеров детергента, в котором неполярные концы изолированы внутрь, избегая воздействия воды, а полярные концы ориентированы наружу при контакте с водой.

Идеализированная структура мицеллы детергента.

---

Как количество мономеров детергента на мицеллу (число агрегации), так и диапазон концентрации детергента, выше которого образуются мицеллы (так называемая критическая концентрация мицелл, CMC), являются свойствами, специфичными для каждого конкретного детергента (см. Таблицу).Критическая температура мицелл (CMT) — это самая низкая температура, при которой мицеллы могут образовываться. CMT соответствует так называемой температуре помутнения, поскольку мицеллы детергента образуют кристаллические суспензии при температурах ниже CMT и снова становятся прозрачными при температурах выше CMT.

На свойства моющего средства влияют такие экспериментальные условия, как концентрация, температура, pH буферного раствора и ионная сила, а также наличие различных добавок. Например, CMC некоторых неионных детергентов уменьшается с повышением температуры, в то время как CMC ионных детергентов уменьшается с добавлением противоиона в результате уменьшения электростатического отталкивания между заряженными головными группами.В других случаях добавки, такие как мочевина, эффективно нарушают структуру воды и вызывают снижение содержания КМЦ моющего средства. Как правило, с увеличением ионной силы происходит резкое увеличение числа агрегаций.

Детергенты могут быть денатурирующими или неденатурирующими по отношению к структуре белка. Денатурирующие детергенты могут быть анионными, такими как додецилсульфат натрия (SDS), или катионными, такими как бромид этилтриметиламмония. Эти детергенты полностью разрушают мембраны и денатурируют белки, нарушая межбелковые взаимодействия.Неденатурирующие детергенты можно разделить на неионные детергенты, такие как Triton X-100, соли желчных кислот, такие как холат, и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS.

Свойства обычных моющих средств.

Моющее средство	Тип	Агрег. № ‡	МВт моно (мицелла)	КМЦ мМ (% мас. / Об.)	Облако точка ° C	Dialyzable
Thermo Scientific Triton X-100	Неионный	140	647 (90K)	0.24 (0,0155)	64	Нет
Thermo Scientific Triton X-114	Неионный	—	537 (-)	0,21 (0,0113)	23	Нет
NP- 40	Неионный	149	617 (90K)	0,29 (0,0179)	80	Нет
Thermo Scientific Brij-35	Неионный	40	1225 (49K)	0.09 (0,0110)	> 100	Нет
Thermo Scientific Brij-58	Неионный	70	1120 (82K)	0,08 (0,0086)	> 100	Нет
Thermo Scientific Tween 20	Nonionic	—	1228 (-)	0,06 (0,0074)	95	Нет
Thermo Scientific Tween 80	Nonionic	60	1310 (76K)	0 . 01 (0,0016)	—	Нет
Октилглюкозид	Неионогенный	27	292 (8K)	23-24 (~ 0,70)	> 100	Да
Октилтиоглюкозид	Неионный	—	308 (-)	9 (0,2772)	> 100	Да
SDS	Анионный	62	288 (18K)	6-8 (0,17- 0,23)	> 100	Нет
CHAPS	Цвиттерионный	10	615 (6K)	8-10 (0.5-0,6)	> 100	Да
CHAPSO	Цвиттерионный	11	631 (7K)	8-10 (~ 0,505)	90	Да

‡ Agg. # = Число агрегации, которое представляет собой количество молекул на мицеллу.

---

Очищенные моющие растворы

Хотя моющие средства доступны из нескольких коммерческих источников и обычно используются во многих исследовательских лабораториях, важность чистоты и стабильности моющих средств не получила широкого признания. Моющие средства часто содержат следовые примеси, полученные при их производстве. Некоторые из этих примесей, особенно пероксиды, которые содержатся в большинстве неионных моющих средств, нарушают активность белка. Кроме того, некоторые типы моющих средств легко окисляются при воздействии воздуха или УФ-излучения, что приводит к потере их свойств и активности в качестве солюбилизирующих агентов. Мы предлагаем несколько моющих средств высокой чистоты с низким содержанием пероксидов, которые расфасованы под азотом в прозрачные стеклянные ампулы. Эти моющие средства Thermo Scientific Surfact-Amps обеспечивают непревзойденное удобство, качество и постоянство для всех применений моющих средств.Набор пробоотборника включает 10 различных очищенных моющих средств (семь в формате Surfact-Amps и три в твердом виде).

---

Структура клеточной мембраны, солюбилизация белков и детергенты

Строение клеточных мембран

Основным фактором, определяющим поведение и взаимодействие молекул в биологических образцах, является их гидрофильность или гидрофобность. Большинство белков и других молекул с заряженными или полярными функциональными группами растворимы (или смешиваются) в воде, поскольку они участвуют в высокоупорядоченной межмолекулярной структуре воды с водородными связями.Некоторые другие белки (или, по крайней мере, части белков), а также жиры и липиды не имеют полярных или заряженных функциональных групп; следовательно, они исключены из упорядоченного взаимодействия воды с другими полярными молекулами и имеют тенденцию объединяться в структуры, имеющие минимальную площадь контакта с полярным окружением. Эта ассоциация неполярных молекул в водных растворах обычно называется гидрофобным притяжением, хотя более точно ее следует понимать как исключение из гидрофильной среды.

Образование и стабильность биологических мембран в значительной степени являются результатом гидрофобного притяжения фосфолипидов, которые образуют двухслойные листы, имеющие гидрофобные липидные «хвосты», ориентированные в пределах толщины листа, и полярные «головные» группы, ориентированные на внешнюю и внутреннюю водную среду. Мембранные белки полностью покрывают толщину мембраны или встроены с одной стороны мембраны в соответствии с их структурой гидрофобных и гидрофильных боковых цепей аминокислот и других функциональных групп.

Разрушение мембраны, связывание с белками и солюбилизация

Обычно умеренные концентрации мягких (т.е. неионных) детергентов нарушают целостность клеточных мембран, тем самым облегчая лизис клеток и экстракцию растворимого белка, часто в нативной форме. При определенных буферных условиях различные детергенты эффективно проникают между бислоями мембраны в концентрациях, достаточных для образования смешанных мицелл с изолированными фосфолипидами и мембранными белками.

Лизис клеток на основе детергентов. Для процедур экстракции белков можно использовать как денатурирующие, так и неденатурирующие реагенты для лизиса клеток.

---

Денатурирующие детергенты, такие как SDS, связываются как с мембранными (гидрофобными), так и с немембранными (водорастворимыми, гидрофильными) белками при концентрациях ниже CMC (то есть в виде мономеров). Реакция является равновесной до насыщения. Следовательно, свободная концентрация мономеров определяет концентрацию детергента.Связывание SDS является кооперативным (т.е. связывание одной молекулы SDS увеличивает вероятность связывания другой молекулы SDS с этим белком) и превращает большинство белков в жесткие стержни, длина которых пропорциональна молекулярной массе.

Неденатурирующие детергенты, такие как Triton X-100, имеют жесткие и объемные неполярные головки, которые не проникают в водорастворимые белки; следовательно, они обычно не нарушают нативных взаимодействий и структур водорастворимых белков и не обладают свойствами кооперативного связывания.Основной эффект неденатурирующих детергентов — связываться с гидрофобными частями мембранных белков, тем самым придавая им смешиваемость.

При концентрациях ниже CMC мономеры детергента связываются с водорастворимыми белками. Выше CMC связывание детергента с белками конкурирует с самоассоциацией молекул детергента в мицеллы. Следовательно, при увеличении концентрации детергента сверх КМЦ увеличение количества мономеров детергента, связанных с белком, не происходит.

Детергентные мономеры солюбилизируют мембранные белки, разделяясь на бислой мембраны. С увеличением количества моющих средств мембраны проходят различные стадии солюбилизации. Начальная стадия — лизис или разрыв оболочки. При молярном соотношении детергент: мембранный липид от 0,1: 1 до 1: 1 липидный бислой обычно остается неповрежденным, но происходит избирательная экстракция некоторых мембранных белков. При увеличении соотношения до 2: 1 происходит солюбилизация мембраны, в результате чего образуются смешанные мицеллы.К ним относятся мицеллы фосфолипид-детергент, мицеллы детергент-белок и мицеллы липид-детергент-белок. При соотношении 10: 1 все взаимодействия липид: белок нативной мембраны эффективно заменяются на взаимодействия детергент: белок.

Количество детергента, необходимое для оптимальной экстракции белка, зависит от CMC, числа агрегации, температуры и природы мембраны и детергента. Буфер для солюбилизации должен содержать достаточное количество детергента, чтобы обеспечить более 1 мицеллы на молекулу мембранного белка, чтобы гарантировать, что отдельные молекулы белка изолированы в отдельные мицеллы.

Моющие средства, используемые для лизиса клеток. Основные характеристики денатурирующих и неденатурирующих детергентов, используемых для экстракции белков.

---

Методы удаления моющих средств

Удаление детергента из солюбилизированных белков

Каким бы необходимым и полезным ни было использование детергента для начального лизиса клеток или экстракции мембранных белков, последующие применения или эксперименты с экстрагированными белками могут потребовать удаления части или всего детергента.Например, хотя многие водорастворимые белки являются функциональными в форме, растворенной в детергенте, мембранные белки часто модифицируются и инактивируются солюбилизацией детергента в результате нарушения взаимодействия природных липидов. В некоторых таких случаях функция мембранных белков восстанавливается, когда они восстанавливаются в двухслойные мембраны путем замены детергента фосфолипидами или другими мембраноподобными липидными смесями.

Функцию отдельного белка можно изучать изолированно, если его сначала очистить, а затем воссоздать в искусственной мембране (хотя восстановление нативной ориентации в мембране является серьезной проблемой).Даже если восстановление функции белка не является проблемой, может потребоваться уменьшить концентрацию детергента в образце, чтобы сделать его совместимым с анализами белка или гель-электрофорезом.

Удалить моющее средство можно разными способами. Диализ эффективен для удаления детергентов с очень высокими КМЦ и / или небольшими числами агрегации, таких как N-октилглюкозиды. Детергенты с низким содержанием КМЦ и большим числом агрегации не могут быть подвергнуты диализу, поскольку большинство молекул детергента будут находиться в мицеллах, которые слишком велики, чтобы диффундировать через поры диализной мембраны; только избыток мономера может быть подвергнут диализу. Ионообменная хроматография с использованием подходящих условий для селективного связывания и элюирования представляющих интерес белков является еще одним эффективным способом удаления детергента. Также можно использовать градиентное разделение сахарозы.

Посмотрите это видео, чтобы узнать больше о диализе протеина

---

Рекомендуемая литература

1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook. Третье издание. Нью-Йорк (Нью-Йорк): Springer-Verlag New York, LLC.

Моющие средства для очистки и кристаллизации мембранных белков

Детергенты играют важную роль в структурных и функциональных характеристиках интегральных мембранных белков (IMP).IMP находятся в биологических мембранах и демонстрируют большие различия в своих структурных и физических свойствах. Для биофизических исследований in vitro, структурного и функционального анализа IMP должны быть извлечены из среды мембранного липидного бислоя, в которой они обнаружены, и очищены до гомогенности при сохранении свернутого и функционально активного состояния. Детергенты способны успешно солюбилизировать и извлекать IMP из бислоев мембраны. Ряд моющих средств с различной структурой и физико-химическими свойствами имеется в продаже и может применяться для этой цели.Тем не менее, важно выбрать детергент, который не только способен извлекать мембранный белок, но и обеспечивать оптимальную среду, сохраняя правильные структурные и физические свойства белковой молекулы. Выбор лучшего моющего средства для этой задачи может стать возможным благодаря пониманию физических и химических свойств различных моющих средств и их взаимодействия с IMP. Кроме того, понимание механизма солюбилизации мембран и экстракции белка, а также требований к кристаллизации, если будут проведены кристаллографические исследования, может помочь в выборе лучшего моющего средства для этой цели.В этой главе представлены основные свойства моющих средств и выделена информация, относящаяся к кристаллизации IMP. В первом разделе главы рассматриваются физико-химические свойства моющих средств и параметры, необходимые для прогнозирования их поведения в растворе. Второй раздел посвящен взаимодействию детергентов с биологическими мембранами и белками, а также их роли в кристаллизации мембранных белков. В последнем разделе будут кратко рассмотрены типы моющих средств и их свойства с упором на специально разработанные детергенты для исследований мембранных белков.

Ключевые слова: Кристаллизация; Моющие средства; Липиды; Мембранные белки; Мицеллы; Очистка белков.

Мембранные белки, липиды и детергенты: не просто мыльная опера

https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2004.04.011Получить права и содержание

Аннотация

Изучение мембранных белков представляет собой серьезную проблему в биохимии белков, при этом одной из основных трудностей являются проблемы, возникающие при работе за пределами естественной липидной среды.Исследования in vitro, такие как кристаллизация, зависят от успешной солюбилизации или восстановления мембранных белков, что обычно включает тщательный выбор солюбилизирующих детергентов и смешанных систем липид / детергент. Этот обзор будет сосредоточен на методах, доступных в настоящее время для эффективного восстановления и солюбилизации мембранных белков с помощью мицелл детергентов, смешанных липидных / детергентных мицелл и бицелл или липосом. Мы фокусируемся на соответствующих молекулярных свойствах детергентов и липидов, которые помогают понять эти процессы.Существенным препятствием для исследований мембранного белка является сохранение стабильности и функции белка во время солюбилизации, восстановления и кристаллизации. Мы выделяем некоторые уроки, извлеченные из исследований сворачивания мембранных белков in vitro, и даем обзор роли, которую липиды могут играть в стабилизации белков.

Аббревиатуры

LCHII

светособирающий комплекс

DAGK

диацилглицерин киназа

SDS

додецилсульфат натрия

OG

n -октил-β-d-глюкопиранозид

DDMcyl-d-d-глюкопиранозид

DDAO-

—

50

додецилдиметил- N -аминоксид

DMPC

1,2-димиристоил- sn -глицеро-3-фосфохолин

CHAPS

3 — [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропан-диметиламмонио] -1-

-MGD-

-диосульфонилдиметиламмонио] -1-пропан-сульфон-диметиламмонио] -1-пропансульфонил-

дигалактозилдиацилглицерин

DPPG

l-α-дипальмитоилфосфатидилхолин

DOPG

l-α-диолеоилфосфатидилглицерин

DOPC

l-α-1,2-DHleylphospatidylcholine E-

dylcholine α-

dylcholine α-

dylcholine 1,2-дигексаноилфосфатидилхолин

POPC

1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин

CHAPSO

3 — [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -2-гидроксил-1-пропансульфонат

E

coli белок A внешней мембраны

OmpF

E. coli белок внешней мембраны F

Ключевые слова

Мембранные белки

Липид

Детергент

Бактериородопсин

Реконструкция статей

000 Рекомендуемые статьи

000 Copyright © 2004 Издано Elsevier BV

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Пептидиск, простой метод стабилизации белков мембраны в растворе без детергентов

[Примечание редакции: ответы автора на первый раунд рецензирования приводятся ниже.]

Рецензент № 1:

[…] 1) Используемые белки представляют собой относительно большие мембранные белковые комплексы или белки b-бочонка, которые стабильны даже в мицеллах детергента. Для этих мембранных белков хорошей альтернативой будет пептидиск. Однако для мембранных белков, которые нестабильны в мицеллах детергента, экспрессируются бесклеточно или ресолюбилизируются из телец включения, неясно, могут ли они быть стабилизированы этими дисками. GPCR или транспортер были бы хорошей альтернативой.

Мы согласны с рецензентом, пептидиск, как и другие имитаторы, не будет работать с белками, которые трудно очистить или которые слишком нестабильны в моющем средстве. Однако в случае комплекса BRC мы наблюдаем 100-кратное увеличение стабильности пептидного детергента по сравнению с детергентом LDAO при повышенной температуре. Ближайшая цель нашей работы — представить пептидиск как новый инструмент, чтобы другие исследователи могли его протестировать на их любимой мишени. Например, текущая биохимическая работа над GPCRs включает амфиполы, а не столько нанодиски, возможно, из-за необходимого добавления экзогенных липидов, которые затрудняют восстановление.Следовательно, пептидиск также может заменить амфиполы, которые по своей природе являются полидисперсными. Дальнейшие исследования, характеризующие полезность пептидиска для бесклеточных систем экспрессии, безусловно, представляют интерес, однако выходящие за рамки этой вводной статьи. Мы считаем, что бесклеточная экспрессия должна быть исследована как отдельное исследование со всеми различными возможными мембранными миметиками (нанодиски / SMA / пептергенты и т. Д.), Чтобы быть действительно полезными.

2) Одно из преимуществ перед нанодисками, которое рекламируют авторы, состоит в том, что пептидиски можно использовать для структурных исследований.Было бы хорошо показать, например, спектр ЯМР мембранного белка в таком пептидиске и показать, что это преимущества по сравнению с нанодисками большего размера.

Мы только упомянули, что пептидиски, учитывая их однородность по составу, должны быть полезны для структурных исследований. Однако наша лаборатория не оборудована для такого структурного анализа, но мы активно ищем сотрудников.

Рецензент № 2:

Рукопись Карлсона и др.включает в себя значительный объем данных о пяти различных мембранных белках, солюбилизированных в двухспиральные пептиды. Это сочетается с тремя методами восстановления для переноса белков в пептидиски на колонках, шариках или гелях. Таким образом, он потенциально обеспечивает полезный методологический прогресс и эталон в быстро развивающейся области подготовки и анализа мембранных белков на дисках нанометрового размера. Однако есть преувеличения и неясность ключевых моментов, которые необходимо рассмотреть.

В аннотации говорится, что «пептидиск просто требует короткого амфипатического бипирального пептида (NSP) и никаких дополнительных липидов». Однако изначально белки получают с использованием детергентов и экспрессируются в E. coli. Следовательно, рекомбинантная экспрессия, например, в Также необходимы кишечная палочка и детергент.

Чтобы предотвратить дальнейшую путаницу, мы изменили это утверждение на «Для восстановления мембранного белка, солюбилизированного детергентом, в пептидиск требуется только короткое время»,

Авторы продолжают говорить, что «Этот недостаток побудил исследователей разработать альтернативы без детергентов, такие как амфиполы, [Popot, 2010] SMALP, [Lee et al., 2016] сапозин-липочастицы [Frauenfeld et al., 2016] и популярная система нанодисков [Bayburt, Grinkova and Sligar, 2004; Денисов и др., 2004] «Опять же, некоторые из этих методов также требуют добавления детергента. Это различие требует уточнения.

Мы ввели новый раздел во Введении, чтобы представить и объяснить основные различия между синтетическими каркасами и другими альтернативами, не содержащими моющих средств.

Заявление «Мы представляем здесь пептидиск как простой метод сборки для поддержки мембранного белка в растворе без детергента» аналогичным образом необходимо исправить, поскольку неясно, являются ли эти методы простыми или не содержащими детергентов.

Это и то, и другое. Мы перефразировали это утверждение.

Заключительное утверждение во Введении о том, что «мы показываем, что пептид NSP вполне может быть универсальным каркасом для стабилизации как α-спиральных, так и β-цилиндрических мембранных белков различного размера, топологии и сложности», и после обсуждения, что «Эти преимущества в совокупности предполагают, что пептидиск должен уменьшить проблемы, связанные с биохимическими, структурными и фармакологическими характеристиками мембранных белков, что делает пептидиск эффективным и, возможно, универсальным инструментом для стабилизации этих белков в растворе, не содержащем мембран и детергентов ». Чтобы эта статья была полезной, авторам необходимо указать ограничения метода.

Первоначальное обсуждение было очень коротким, потому что мы изначально представили этот документ как метод. Теперь мы полностью пересмотрели обсуждение, чтобы выделить плюсы и минусы различных каркасов, а также то, где другие методы могут быть более подходящими. Мы также увеличили введение, чтобы представить эти другие методы и то, почему пептидиск явно превосходит некоторые конкретные аспекты.

В материалах и методах, используемых для восстановления пептидисков на колонке, используются такие детергенты, как LDAO. Не денатурирует ли сам пептид в таких детергентах, и не ограничивает ли это эффективность этого реагента?

Восстановление в пептидиске, как и в нанодиске, происходит при разбавлении детергента. Это разрушает мицеллу, позволяя пептиду складываться вокруг целевых белков. Развертывание пептида не является проблемой. Наши данные показывают, что LDAO не ограничивает эффективность метода.

Выход, чистота и активность должны быть даны количественно для каждого белка в пептидиске по сравнению с одним детергентом, а в идеале также по сравнению с липосомами. Это позволит объективно сравнить методы. Не требуют ли предлагаемые методы детергента, который может удалить природно связанные липиды и дестабилизировать мембранные белки? Разве это не ограничение?

Мы провели параллельное сравнение комплекса BRC, восстановленного в липосомах, нанодисках, пептидисках, полимере SMA и детергенте LDAO, и представили результаты в отредактированной рукописи.Все мембранные миметические системы демонстрируют аналогичное повышение термостабильности. Делипидация — это общая проблема солюбилизации детергента. Однако мы показываем, что пептид увеличивает термостабильность делипидированного комплекса BRC. Вероятно, это связано с i) удалением денатурирующих детергентов и ii) более стабильной гидрофобной средой по сравнению с мицеллой детергента. Таким образом, даже без дополнительных липидов пептидиск способен стабилизировать BRC в такой же степени, как и в протеолипосомах (рисунок 10 — рисунок в приложении 1). Делипидирование с помощью детергентов также может быть полезным для повышения чистоты мембранных белков. Например, во время очистки FhuA внутренняя мембрана сначала удаляется путем солюбилизации в Triton X-100 перед добавлением LDAO для высвобождения FhuA из внешней мембраны. Это значительно увеличивает конечную чистоту.

В идеале анализы должны проводиться в диапазоне температур, чтобы гарантировать, что измеряется активность свернутого белка.

Мы показали, что MalFGK ₂ в пептидиске остается свернутым на протяжении всего восстановления с использованием анализов активности BN-PAGE и АТФазы.

Идентичность связанных липидов также должна быть указана, а не неспецифические утверждения о содержании липидов, например: «Кроме того, поскольку липиды (т. Е. Кольцевые липиды) могут оставаться прочно связанными с мембранными белками во время очистки [Bechara et al., 2015], мы также определяли содержание липидов с помощью методов тонкослойной хроматографии и фотоколориметрии »и« Следуя тому же подходу, который применялся к MalFGK ₂ , описанному выше, мы количественно оценили отдельные пептидные и липидные компоненты пептидиска FhuA (рис. 3B и A), в результате чего получили среднее 8 ± 3 фосфолипидов и 10 ± 2 NSP на пептидиск FhuA ».Низкое количество присутствующих липидных молекул (4 и 8 в случае BRC и FhuA) указывает на то, что в пептидиске остаются только наиболее прочно связанные липиды, и что нельзя предполагать форму диска.

Мы включили данные об идентичности связанных липидов с MalFGK ₂ . Мы также показываем, что FhuA и BRC имеют очень низкое содержание липидов. Однако мы не согласны с тем, что это исключает форму диска, поскольку как периплазматическая, так и цитоплазматическая стороны FhuA все еще доступны для его растворимых партнеров по связыванию.Следовательно, основная масса пептида должна располагаться вокруг трансмембранных доменов переносчика. Это подтверждают данные электронной микроскопии, включенные в рукопись. Мы расширили обсуждение, чтобы описать возможный способ ассоциации пептида с белком-мишенью.

Присутствие явно нефизиологического мультимера (Sec (EYG) n) на Рисунке 2D замаскировано. Это необходимо объяснить, поскольку это указывает на то, что использование NSP приводит к потенциально артефактическим мультимерным состояниям.

Об олигомерной предрасположенности SecEYG сообщалось в прошлом многими исследователями. Это не артефакт, и мы упоминали об этом в рукописи. Наши данные показывают, что пептидиск может захватывать эти олигомеры.

На рис. 2F, почему белки с разной молекулярной массой имеют один и тот же RR50? Неужели нельзя было ожидать увидеть большее количество пептидов, взаимодействующих с большей сборкой или с другими мембранами или типами клеток? Авторы не объяснили свою точку зрения на это, и неясно, как это было оптимизировано, несмотря на то, что это значительная стоимость и определяющий фактор успеха метода.Рекомендуемая молярная концентрация пептида для восстановления должна быть указана и обоснована.

Мы обсудили этот момент более подробно в Обсуждении и предлагаем наклонную конформацию пептида для объяснения этого интересного наблюдения. Мы также включили рекомендуемую молярную концентрацию пептида, которая подтверждается экспериментами по восстановлению в геле.

Описание пептида как пояса вокруг белка и дискообразной формы пептидисков должно быть подтверждено экспериментальными данными и / или ссылками.

Теперь у нас есть расширенное обсуждение возможных ориентаций пептида в Обсуждении. Форма диска четко видна в наших экспериментах с отрицательным окрашиванием.

Имеется один набор данных EM отрицательного окрашивания MalFGK ₂ на пептидисках, показывающий наличие ряда пар и троек дисков. Разве это не значимо и не указывает на взаимодействие диска с диском, возможно, опосредованное пептидами NSP? Если да, то не следует ли использовать более низкие концентрации пептидов для минимизации таких сумм в биофизических анализах?

Препарат пептидиск MalFGK ₂ является монодисперсным, см. Отрицательный анализ окраски, рис. 1C.Нам неясно, где обозреватель видит стопку дисков?

Кроме того, масштабная линейка на нижней панели рисунка 1С, по-видимому, указывает 50 (а не 5) Å . Если так, то это непоследовательно.

На рис. 2С показано среднее значение класса одного нанодиска. 10 Å = 1 нанометр. Диск, содержащий MalFGK ₂ , имеет диаметр примерно 11-12 нм. Таким образом, масштабная линейка верна и соответствует указанным в тексте измерениям.

Рецензент № 3:

[…] Рукопись кажется убедительной с точки зрения биофизических анализов комплексов пептидиск и их содержания пептидов NSP и кольцевых липидов.Тем не менее, я немного скептически отношусь к тому, что пептидиск представляет собой реконструкцию в классическом смысле, потому что пептиды NSP напрямую взаимодействуют с трансмембранными спиралями (управляемыми гидрофобными белок-белковыми взаимодействиями, опосредованными боковыми цепями аминокислот), а не липидами через их алифатические жирные кислоты. кислотные цепи. Тем не менее, этот метод (хотя и не является новой концепцией, как описано ниже) кажется довольно простым и универсальным в применении.

1) Взаимодействие — мы включили полное обсуждение возможного способа взаимодействия пептида с целевым мембранным белком.Важно отметить, что мы показываем, что пептидиск представляет собой «истинное» воссоздание, потому что он полностью стабилен при удалении из избытка пептида, почти так же, как нанодиск или амфиполы. Это отличается от других пептидных каркасов (липопептидов и пептергентов), которые должны поддерживаться в буфере выше их КМЦ для поддержания растворимости белка.

2) Новизна — мы тщательно рассмотрели вопрос новизны в разделе «Введение» и «Обсуждение», включив сравнения (за и против) с другими пептидными каркасами, белковыми каркасами и синтетическими каркасами.Хотя концепция захвата мембранных белков каркасом не нова, нам не известны другие отчеты, показывающие функциональное термостабильное восстановление белка в пептидисках.

1) Как потенциальному будущему пользователю (и нынешнему пользователю метода нанодисков) очень важно знать, насколько дорогим является синтез (или любой альтернативный препарат) пептида NSP. Я предполагаю, что он дороже, чем моющие средства, но в отличие от белка MSP, используемого для нанодисков, он может быть дешевле.В том же духе авторы заявили, что чистота их химически синтезированного пептида NSP составляла «более 80%». Этого достаточно? Какие примеси. Связана ли эта довольно низкая чистота с ценой синтеза?

Даже пептиды низкой чистоты по-прежнему «чище» по сравнению с другими каркасами мембранных белков MSP, которые загрязнены липидами и другими белками из-за экспрессии рекомбинантных клеточных белков (основная проблема для биотехнологической промышленности при создании антител против мембранных белков, стабилизированных на нанодисках) .В пептидиске основная масса «примесей» состоит из NSP _r , в котором отсутствует его последняя аминокислота (аспартат) во время синтеза. По сравнению с белком MSP, указанным в Sigma Aldrich, этот пептид дешевле. Мы включили комментарии по этим вопросам в Обсуждение.

2) Насколько пептидиски подвержены агрегации? Авторы предполагают, что пептиды NSP образуют регулярный пояс вокруг мембранного белка, похожий на пояс MSP. Но реально ли это? Понятно, что пептиды расположены так, что гидрофобные части мембранного белка покрываются его гидрофобной стороной, в то время как гидрофильная сторона пептидов остается открытой для растворителя.Но этот процесс, вероятно, будет стохастическим в том смысле, что остаются гидрофобные промежутки на поверхности мембранного белка, а также на некоторых неидеально размещенных пептидах NSP. Эти оставшиеся гидрофобные поверхности затем будут служить точками зародышеобразования для агрегации белка. Оставшиеся молекулы детергента, возникающие в результате солюбилизации и очистки мембранного белка, могут защищать эти оставшиеся гидрофобные поверхности.

Этот рецензент поднимает очень важные и фундаментальные вопросы, и те же самые вопросы относятся также к полимерным системам на основе нанодисков и SMA. Согласно нашим экспериментам, детергент, по-видимому, полностью исключен из пептидиска, поскольку характерные эффекты среды детергента на активность и стабильность белка не наблюдаются после того, как белок переносится в пептидиск. Экспериментальные данные показывают, что агрегации не происходит и система очень устойчива в водном растворе. Мы также пересмотрели обсуждение, чтобы прояснить, как пептид может ориентироваться вокруг мембранного белка в пептидиске, чтобы учесть проблему открытых алкильных цепей.

3) В связи с вышеприведенным комментарием: содержат ли пептидиски детергенты? Хорошо известно, что количественная замена моющего средства — задача нетривиальная. Часто исходный детергент, используемый для солюбилизации мембранного белка, до некоторой степени остается. Авторам необходимо показать, остались ли в пептидисках какие-то детергенты (рядом с кольцевыми липидами и пептидом NSP).

Исходя из высокой степени корреляции между рассчитанными нами и наблюдаемыми массами пептидисков, вероятно, что большая часть, если не весь детергент удаляется из пептидиска. Кроме того, во всех случаях замены детергента на пептидис наблюдаются значительные изменения ферментативной активности или термостабильности, что позволяет предположить, что даже если остается небольшое количество детергента, денатурирующий эффект среды детергента не проявляется. Мы обсудили этот момент в расширенном тексте.

4) Насколько большой ремень NSP по сравнению с ремнями для моющих средств разных размеров? Этот вопрос очень актуален для кристаллизации мембранных белков. Пептидиск кажется более компактным, чем нанодиск, и мембранные белки в пептидисках могут кристаллизоваться.Пытались ли авторы кристаллизовать свои пять мембранных белков, использованных в этом исследовании, для которых существуют кристаллические структуры с высоким разрешением (определенные в детергенте)?

Мы также очень рады возможности получить кристаллы! Испытания кристаллов продолжаются, и на основании ЭМ-сравнений MalFGK ₂ мы также считаем, что пептидиск более компактный, чем нанодиск. Однако оптимизация кристаллов и использование пептидиска для исследований кристаллизации выходят за рамки данной статьи.

5) Действительно ли пептидиск имитирует естественную среду мембранного белка? Авторы тщательно выяснили, что пептидиск содержит кольцевые липиды. Однако кольцевые липиды также содержатся в очищенных детергентом образцах. Авторы должны решить этот вопрос, сравнивая содержание кольцевых липидов бок о бок и с течением времени, используя тот же транспортер, очищенный как в детергенте, так и в пептидисках, и измеряя с помощью масс-спектрометрии массу (или потерю массы с течением времени) весь комплекс.

Этот вопрос относится и ко всем другим системам мембранных каркасов. Пептидиск явно более щадящая среда, чем мицелла детергента. Сравнение BRC, восстановленного в SMA, нанодисках, пептидисках и протеолипосомах, показывает, что все эти мембранные миметики приводят к сопоставимому увеличению термостабильности белка. Однако пептидиск также сохраняет способность белка связывать поверхностные лиганды, как показано в рукописи, с FhuA / ColM / Ferricrocin и MalFGK ₂ -MalE.В детергентах эти белки проявляют связывание / активность, несовместимую с их характеристиками в липидной системе.

6) В рукописи отсутствует надлежащее обсуждение. Наиболее проблематично то, что авторы вообще не обсуждают, что концепция пептидов, используемых в качестве суррогатов детергентов, вовсе не нова. Скорее всего, он был впервые описан в 80-х и 90-х годах как пептитергент (вы можете найти это слово даже в Википедии). См. Также в Schafmeister CE, Miercke LJ, Stroud RM. Структура на 2,5 A сконструированного пептида, который поддерживает растворимость мембранных белков.Наука. 1993 29 октября; 262 (5134): 734-8. Кроме того, существуют липопептидные детергенты (LPD), наноструктурированные β-листы (см. Tao H, Lee SC, Moeller A, Roy RS, Siu FY, Zimmermann J, Stevens RC, Potter CS, Carragher B, Zhang Q. Engineered наноструктурированные пептиды β-слоя защищают мембранные белки. Nat Methods.2013 Aug; 10 (8): 759-61). Кроме того, были разработаны короткие пептиды для стабилизации мембран, которые намного дешевле производить, чем пептид NSP из 37 аминокислот (см. Kiley P, Zhao X, Vaughn M, Baldo MA, Bruce BD, Zhang S.Самособирающиеся пептидные детергенты стабилизируют изолированную фотосистему I на сухой поверхности в течение длительного времени. PLoS Biol. 2005 июл; 3 (7): e230. Epub 2005, 21 июня)

Важным является вопрос, превосходит ли пептид NSP вообще или в какой степени эти ранее описанные методы с использованием амфифильных пептидов, в частности коротких дизайнерских пептидов, как описано у Kiley et al., 2005). Крайне важно, чтобы этот вопрос был решен экспериментально с помощью функционального анализа, включающего переносчик мальтозы и / или BRC.

Полностью согласны с рецензентом. Рукопись изначально была представлена ​​как краткое сообщение с ограничениями по тексту. Мы переписали разделы «Введение» и «Обсуждение», чтобы можно было учесть многие хорошо продуманные комментарии выше. В пересмотренной рукописи мы объясняем, почему пептидиск превосходит предыдущие методы на основе пептидов, а также обращаемся к системам на основе синтетических полимеров, основанных на белковых каркасах. Мы комментируем возможные ориентации пептида в пептидиске, а также возможность того, что детергенты останутся в частицах.

Обсуждение должно также включать концепцию стабилизации мембранных белков посредством пептидно-белковых взаимодействий (пептидиск) по сравнению с взаимодействиями липидных белков (нанодиск / сапозины / протеолипосомы). И, наконец, необходимо более подробно рассмотреть амфиполы (которые концептуально наиболее тесно связаны с пептитергентами и пептидисками).

Мы изменили Обсуждение, чтобы охватить эти моменты более подробно.

[Примечание редакции: ответы автора на повторную рецензию приводятся ниже.]

Рукопись была улучшена, но остаются некоторые проблемы, которые необходимо решить перед принятием, как указано ниже:

1) Что интересно в пересмотренной версии, так это тот факт, что последовательность исходного пептида NSP в том виде, в каком он присутствует в ApoA1, фактически была обратной, и это привело к увеличению растворимости пептида. Почему эта информация полностью отсутствовала в первой версии?

Последовательность, использованная в этом исследовании, последовательно указывается в дополнительной таблице и обозначается как NSP (т.е. наноразмерный пептид), поскольку мы не обнаружили значительных различий в эффективности восстановления по сравнению с последовательностью NSP, описанной Kariyazono et al. Однако проблемы низкой растворимости стали для нас более очевидными после представления первой версии рукописи. Поэтому мы сочли важным представить эту информацию в новой редакции, включить дополнительные экспериментальные данные, а также определить момент гидрофобности для объяснения этой разницы (Рисунок 8 — рисунок в приложении 1). Во избежание путаницы с Кариязоно и соавт., нам пришлось переименовать эту последовательность в NSP _r в пересмотренной версии, и было очевидной ошибкой не обозначить ее как таковую в первом представлении.

2) Точная последовательность пептида NSPr должна быть указана непосредственно в разделе «Материалы и методы» раздела «Биологические реагенты и пептиды» (мне было трудно найти ее в дополнительном файле 1).

Последовательность NSPr была добавлена ​​в раздел «Материалы и методы рукописи», озаглавленный «Пептиды», в дополнение к дополнительному файлу 1.

3) В рукописи авторы указывают, что метод недорогой. Однако мне все равно было бы интересно узнать, сколько стоит мг или грамм и сколько вам понадобится для эксперимента (с указанием разумного диапазона).

В качестве примера, содержание пептидов в MsbA-peptidisc составляет от общей молекулярной массы. Поэтому при восстановлении MsbA в пептидиске с использованием метода на гранулах в количествах, подходящих для скрининга кристаллизации (~ 20 мг / мл, 200 мкл), используется по крайней мере ~ 1 мг пептида.Стоимость пептида может составлять всего ~ 5-15 $ / мг, цена зависит от поставщика, количества и чистоты, таким образом, стоимость пептида для скрининга кристаллизации может быть в пределах ~ 5-15 $. Эквивалентная сумма MSP (https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6574?lang=en&region=CA) будет стоить около 80 долларов. Конечно, на этапах очистки (IMAC, SEC, этапы концентрации) теряется дополнительный пептид. Окончательная стоимость подготовки этого количества MsbA в пептидиске для скрининга кристаллов в нашей лаборатории составляет 20 долларов, если предположить, что мы теряем около 60% MsbA на этапах очистки.Для сравнения, каждая сидящая кристаллическая пластина Hampton будет стоить около 5 долларов. В случае ЭМ-экспериментов стоимость еще ниже, поскольку требуется меньше белка (5-10 мг / мл). В любом случае метод на гранулах важен для ограничения общей стоимости, поскольку раствор пептидиска можно повторно использовать несколько раз, поскольку только необходимое количество пептида связывает белок. Для сравнения, восстановление на колонке более расточительно, поскольку исходный 10-кратный избыток пептида не может быть восстановлен, поскольку он фракционируется с примесями небольшого размера.В растворах на геле используется примерно 2-8 мкг NSP _r , поэтому затраты на оптимизацию чрезвычайно низки. Еще одно очень важное соображение — это рабочее время, обычно связанное с приготовлением других мембранных каркасов. С пептидиском дело обстоит иначе, поскольку продукт можно производить.

4) Что касается примесей пептида, авторы дали интересный ответ в ответном письме (т.е. что большая часть примеси на самом деле является тем же пептидом, у которого отсутствует конечная аминокислота).Об этом тоже нужно упомянуть в рукописи.

Эта информация и степень чистоты пептидов теперь представлены вместе в одном месте в разделе «Материалы и методы», озаглавленном «Пептиды».

5) Авторы ссылаются на домашнюю страницу, чтобы заказать / получить пептид: www.peptidisc.com. Однако домашняя страница пока работает. Похоже, что авторы создадут или уже создали новую компанию для коммерциализации пептидиска. Необходимо декларировать потенциальные финансовые конкурирующие интересы.

Недавно мы запустили веб-сайт с целью доставить NSP _r в комплекте вместе с модельными мембранными белками, чтобы другие исследователи могли легко воспроизвести эксперименты по восстановлению ядра, которые мы представляем в этой рукописи, прежде чем приступить к своей собственной цели. В рукописи мы упоминали: «Чтобы облегчить доступ академического сообщества, на сайте www.peptidisc.com доступны массовые пептиды NSP _r и основные протоколы», и при необходимости мы можем заявить о конкурирующем финансовом интересе.Наша цель — сделать метод доступным для всех, и предполагаемая стоимость будет отражать небольшую выручку, которая покрывает его распространение и усилия по обеспечению его надлежащего применения, включая технические советы. Мы еще не выпустили веб-сайт из-за того, что статья все еще находится на рассмотрении и скоро после публикации. Мы также назвали другие производители пептидов, которые использовались в этом исследовании. Пептидиск представляет собой дополнительную интересную возможность по сравнению с другими каркасами, поскольку его использование не защищено интеллектуальной собственностью, поэтому его могут легко использовать как ученые, так и промышленность.

https://doi.org/10.7554/eLife.34085.023

Природа детергента и его применение в мембранных белках

---

В последние годы исследования мембранных белков достигли значительного прогресса, который неотделим от разработки связанных с мембранами инструментов и реагентов ^[1] . Среди них детергент играет важную роль в экстракции, очистке и работе мембранного белка. Их амфифильная природа позволяет им взаимодействовать с гидрофобными мембранными белками, извлекать и растворять мембранные белки из природных липидных бислоев.Но растворение не означает, что естественная структура и стабильность белка могут быть полностью восстановлены; Детергент, который может одновременно эффективно извлекать мембранный белок, также может не подходить для очистки и дальнейших биохимических исследований; И моющее средство, подходящее для определенного мембранного белка, может не подходить для другого мембранного белка. Одним словом, не существует набора критериев, по которым можно было бы оценить, подходит ли то или иное детергент для исследования мембранного белка.В этой статье описаны физические и химические свойства моющих средств, а также их применение в процессе мембранного белка. Надеемся, что наше введение поможет вам выбрать правильное моющее средство.

Детергент — это разновидность поверхностно-активного вещества, которое находит широкое применение, в том числе: электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE), растворение телец включения, приготовление липосом, солюбилизация мембранных белков и исследования структуры активности. Более того, детергент также может быть использован в качестве модели мембраны для исследований in vitro .

Функция детергента связана с его структурой: полярная гидрофильная часть молекулы детергента используется в качестве гидрофильной головной группы, а неполярная гидрофобная часть используется в качестве хвостовой части (рис. 1A). Некоторые детергенты также имеют линзовидную форму (рис. 1B), которые имеют полярные и неполярные поверхности, включая производные желчных кислот, такие как CHAPS и CHAPSO.

Рисунок 1 — Мономер моющего средства

Моющие средства можно разделить на ионные (катионные или анионные), неионные и цвиттерионные в соответствии с различными гидрофильными группами.

Ионные детергенты включают додецилсульфат натрия (SDS), N-лаурилсаркозин, CTAB и т.д., которые эффективны при извлечении белков из мембраны. Эти детергенты могут эффективно нарушать взаимодействие между внутримолекулярными и межмолекулярными белками, но они жесткие и склонны денатурировать белок. Среди них соли желчных кислот также являются ионными детергентами, такими как холат натрия и дезоксихолевая кислота, но их скелет состоит из жестких стероидов, которые мягче, чем линейные ионные детергенты.

Неионные детергенты включают мальтозиды, глюкозиды и полиоксиэтиленгликоли. Особенностью этого типа моющего средства является то, что гидрофильные головные группы не заряжаются. Эти детергенты мягкие, неденатурированные и могут нарушать взаимодействия между белково-липидными и липидно-липидными.

К цвиттерионным детергентам относятся цвиттергенты, фос-холины и CHAPS / CHAPSO и т. Д. Их гидрофильные головные группы содержат положительные и отрицательные заряды. Эти детергенты электрически нейтральны, как неионные детергенты, но они обычно способны нарушать взаимодействие между белками, как ионные детергенты, поэтому они мягкие.В наиболее успешных исследованиях белков мембран ЯМР используются цвиттерионные детергенты, например Fos-Choline 12.

Пожалуйста, обратите особое внимание на следующее содержание, если вы хотите узнать больше ……

3 . 1 The C ritical M icelle C концентрация , CMC

Мицеллизация — ключевое явление при рассмотрении вопроса о применении моющих средств.Каждый вид детергентов имеет значение CMC, когда концентрация детергента выше, чем CMC, мономер самоорганизуется в нековалентный агрегат, также называемый мицеллами. На самом деле мицеллообразование не происходит при одной концентрации, а происходит в узком диапазоне концентраций.

При нанесении детергентов на мембранные белки следует руководствоваться одним практическим правилом: рабочая концентрация детергента должна быть не менее 2xCMC, а массовое соотношение детергента к белку — не менее 4: 1.Когда мембранный белок растворяется в исходной мембране, рабочая концентрация детергента намного выше, чем у КМЦ, а молярное отношение детергента к липиду составляет 10: 1. Следовательно, КМЦ определяет количество детергента, добавляемого в различные белки и мембранные продукты ^[2] .

Значение CMC моющего средства не является фиксированным, оно будет меняться в зависимости от pH, ионной силы и температуры раствора ^[3] . Например, значение CMC ионного детергента будет уменьшаться с увеличением ионной силы.

3 . 2 Мицелляция

Мицеллы представляют собой агрегаты мономера детергента в растворе, и процесс образования мицелл называется мицеллообразованием ^[4] . Детергент взаимодействует с мембранным белком и мембраной в виде мицелл, и растворение белка зависит от образования мицелл в растворе. Обычно считается, что мицеллы имеют «шероховатую» поверхность, которая представляет собой динамическую структуру.Мономер детергента в мицеллах быстро обменивается со свободным мономером детергента в растворе. Как только мембранный белок растворяется, мы обычно думаем, что молекулы детергента образуют тор вокруг гидрофобного трансмембранного домена.

4 .1 Замена или R Удаление D моющих средств

Детергенты, которые могут эффективно растворять мембранные белки, могут быть неподходящими для дальнейших биохимических исследований, которые требуют переноса мембранных белков в более подходящий раствор детергента.При сборке липосом или нанодисков нам нужно удалить моющее средство. CMC можно использовать для определения доступного метода замены или удаления нежелательных моющих средств. Детергенты с высоким содержанием CMC легко удаляются посредством диализа, а раствор детергента можно разбавить до значения ниже CMC посредством диализа, тогда мицеллы распадаются на мономеры, и мономеры могут легко проходить через диализную мембрану. Как правило, раствор детергента диализуют буфером без детергента с объемами, превышающими 200-кратный, и меняют буфер несколько раз в средний период, например Fos-Choline 12.Моющие средства с низким содержанием КМЦ обычно удаляются адсорбцией гидрофобных гранул, таких как ДДМ. Его также можно очистить на никелевой колонке. После связывания мембранного белка с материалом колонки замените буфер другим раствором детергента.

4 . 2 Идентификация I M embrane P roteins

Если мембранный белок идентифицируется с помощью SDS-PAGE, обработка кипячением может привести к агрегации мембранных белков.Таким образом, мы можем инкубировать мембранный белок при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем провести гель-электрофорез. Мембранные белки обычно не мигрируют с молекулярной массой, предсказанной в SDS-PAGE. Как правило, они мигрируют быстрее, это означает, что их молекулярная масса будет выглядеть меньше, вероятно, потому, что складка не полная или каждая единица молекулярной массы сочетается с большим количеством SDS, чем водорастворимый белок ^[5] .

Мы только что представили основные свойства моющих средств, но на самом деле приготовление мембранного белка очень сложно.Для большинства мембранных белков трудно получить достаточное количество из естественной окружающей среды, поэтому их необходимо сверхэкспрессировать. К сожалению, трудно получить достаточное количество функционального и стабильного мембранного белка с помощью E.coli или других систем экспрессии. В общем, чем больше у них трансмембранных доменов, тем труднее экспрессировать мембранные белки, такие как аквапорины, содержащие 6 трансмембранных доменов.

5 .1 A квапорины

Аквапорин, расположенный на клеточной мембране, представляет собой трансмембранный белок с 6 трансмембранными доменами, и они образуют «канал» на клеточной мембране, который может контролировать поступление воды в клетку и выход из нее. Молекулы воды образуют единый столб при прохождении через аквапорин, при входе в изогнутый узкий канал внутренняя диполярная сила и полярность помогают молекулам воды вращаться под соответствующим углом через узкий канал.

Аквапорины преимущественно присутствуют в почках млекопитающих, а также существуют в растениях. Аквапорины играют важную роль в концентрации мочи в почках, физиологии пищеварения, нейрофизиологии, физиологии дыхания, физиологии глаз и физиологии кожи.

5 ,2 Активный A квапорины

Cusabio применяет технологию свободной экспрессии клеток E.coli. Технология не ограничена структурой клеток и подходит для экспрессии мембранных белков и токсичных белков, токсичных для клеток, с выходом до уровня мг / мл.Согласно традиционной клеточной экспрессии, обычная обработка мембранных белков требует разрушения клеточной мембраны, что имеет тенденцию вызывать изменение конформации встроенной в нее мембраны или даже денатурацию. Но открытая система бесклеточной экспрессии E.coli может оптимизировать выход экспрессии in vitro несколькими способами, а экспрессированные мембранные белки могут быть немедленно охвачены детергентами после трансляции во время экспрессии, чтобы максимально избежать воздействия водного раствора.Сейчас мы уже успешно разработали следующие активные аквапорины.

5 .2.1 Рекомбинантный Escherichia coli Aquaporin Z (aqpZ)

Функция: канал, обеспечивающий осмотическое движение воды в обоих направлениях. Он участвует в осморегуляции и поддержании тургора клеток во время увеличения объема в быстрорастущих клетках.Он обеспечивает быстрый вход или выход воды в ответ на резкие изменения осмолярности.

Рис 2. aqpZ в мицеллах детергента

Фигура 3. Связывающая активность aqpZ с ytfE.

Активность : измеряется по его связывающей способности в функциональном ELISA. Иммобилизованный aqpZ в концентрации 5 мкг / мл может связывать человеческий ytfE. ЕС ₅₀ белка ytfE человека составляет 197,90-259,70 мкг / мл.

[1] Р.М. Гаравито, С. Фергюсон-Миллер, Моющие средства как инструменты в биохимии мембран, J. Biol. Chem. 276 (2001) 32403–32406.

[2] Anatrace, детергенты и их использование в науке о мембранных белках.

[3] М. Ле Мэр, П. Шампей, Дж. В. Мбллер, Взаимодействие мембранных белков и липидов с солюбилизирующими детергентами, Biochim. Biophys.Acta 1508 (2000) 86–111.

[4] Из Википедии, бесплатной энциклопедии.

[5] Принципы и методы очистки стимулирующих белков, 28-9095-31.

Стратегия восстановления активных ферментных комплексов из природных биологических мембран в наноразмерные диски без использования моющих средств | BMC Biotechnology

1.

Сандерс К.Р., Майерс Дж.К .: Связанная с заболеванием неправильная сборка мембранных белков. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2004, 33: 25-51. 10.1146 / annurev.biophys.33.110502.140348.

Артикул Google ученый

2.

Валлин Э., фон Хейне Г: Полногеномный анализ интегральных мембранных белков эубактериальных, архейских и эукариотических организмов. Protein Sci. 1998, 7 (4): 1029-1038.

Артикул Google ученый

3.

Уайт Ш., Ладохин А.С., Джаясинге С., Христова К. Как мембраны формируют структуру белка. J Biol Chem. 2001, 276 (35): 32395-32398. 10.1074 / jbc.R100008200.

Артикул Google ученый

4.

Lee AG: Как липиды влияют на активность интегральных мембранных белков. Biochim Biophys Acta. 2004, 1666 (1-2): 62-87.

Артикул Google ученый

5.

Charalambous K, Miller D, Curnow P, Booth PJ: Липидный двухслойный состав влияет на небольшие переносчики множества лекарственных препаратов. BMC Biochem. 2008, 9: 31-10.1186 / 1471-2091-9-31.

Артикул Google ученый

6.

Попот Дж. Л.: Амфиполы, нанодиски и фторированные поверхностно-активные вещества: три нетрадиционных подхода к изучению мембранных белков в водных растворах.Анну Рев Биохим. 2010, 79: 737-775. 10.1146 / annurev.biochem.052208.114057.

Артикул Google ученый

7.

Хелениус А., Саймонс К.: Солюбилизация мембран детергентами. Biochim Biophys Acta. 1975, 415 (1): 29-79. 10.1016 / 0304-4157 (75)

-7.

Артикул Google ученый

8.

Стаббс Г.В., Литман Б.Дж .: Влияние изменений в амфипатическом микроокружении на конформационную стабильность бычьего опсина.1. Механизм солюбилизации дисковых мембран неионным детергентом октилглюкозидом. Биохимия. 1978, 17 (2): 215-219. 10.1021 / bi00595a003.

Артикул Google ученый

9.

Богданов М., Се Дж., Доухан В. Липид-белковые взаимодействия управляют топогенезом мембранных белков в соответствии с положительным внутренним правилом. J Biol Chem. 2009, 284 (15): 9637-9641. 10.1074 / jbc.R800081200.

Артикул Google ученый

10.

Брейтон С., Трибет С., Олив Дж., Дубак Дж. П., Попот Дж. Л.: преобразование димера в мономер комплекса цитохрома b6 f. Причины и последствия. J Biol Chem. 1997, 272 (35): 21892-21900. 10.1074 / jbc.272.35.21892.

Артикул Google ученый

11.

Lee AG: Липидно-белковые взаимодействия. Biochem Soc Trans. 2011, 39 (3): 761-766.

Артикул Google ученый

12.

Седдон А.М., Курноу П., Бут П.Дж.: Мембранные белки, липиды и детергенты: не только мыльная опера. Biochim Biophys Acta. 2004, 1666 (1-2): 105-117.

Артикул Google ученый

13.

Нат А., Аткинс В.М., Слигар С.Г .: Применение фосфолипидных двухслойных нанодисков в исследовании мембран и мембранных белков. Биохимия. 2007, 46 (8): 2059-2069. 10.1021 / bi602371n.

Артикул Google ученый

14.

Whiles JA, Deems R, Vold RR, Dennis EA: Бицеллы в исследованиях структуры-функции мембраносвязанных белков. Bioorg Chem. 2002, 30 (6): 431-442. 10.1016 / S0045-2068 (02) 00527-8.

Артикул Google ученый

15.

Джамшад М., Лин Ю.П., Ноулз Т.Дж., Парслоу Р.А., Харрис С., Уитли М., Пойнер Д.Р., Билл Р.М., Томас О.Р., Овердуин М. Очистка мембранных белков без поверхностно-активных веществ с интактной природной мембранной средой. Biochem Soc Trans.2011, 39 (3): 813-818.

Артикул Google ученый

16.

Нат A, Trexler AJ, Koo P, Miranker AD, Atkins WM, Rhoades E: флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул с использованием фосфолипидных двухслойных нанодисков. Методы Энзимол. 2010, 472: 89-117.

Артикул Google ученый

17.

Gluck JM, Wittlich M, Feuerstein S, Hoffmann S, Willbold D, Koenig BW: Интегральные мембранные белки в нанодисках могут быть изучены с помощью спектроскопии ЯМР в растворе.J Am Chem Soc. 2009, 131 (34): 12060-12061. 10.1021 / ja

7p.

Артикул Google ученый

18.

Вадсатер М., Лаурсен Т., Сингха А., Хатзакис Н.С., Стаму Д., Баркер Р., Мортенсен К., Фейденхансл Р., Моллер Б.Л., Карденас М.: Мониторинг сдвигов в конформационном равновесии мембранного белка цитохрома Р450 редуктаза (ПОР) в нанодисках. J Biol Chem. 2012, 287 (41): 34596-34603. 10.1074 / jbc.M112.400085.

Артикул Google ученый

19.

Тонг С.Р., Тайге Б.Дж.: Отзывчивые гидрофобно связывающиеся полимеры: обзор структуры и свойств. Adv Drug Deliv Rev. 2001, 53 (1): 109-122. 10.1016 / S0169-409X (01) 00223-X.

Артикул Google ученый

20.

Попот Дж. Л., Альтхофф Т., Багнард Д., Банерес Дж. Л., Баззакко П., Биллон-Дени Э., Катуар Л. Дж., Шампей П., Чарволин Д., Коко М. Дж.: Амфиполы от А до Я. Анну Рев Биофиз. 2011, 40: 379-408. 10.1146 / annurev-biophys-042910-155219.

Артикул Google ученый

21.

Попот Дж. Л., Берри Э. А., Чарволин Д., Крезене С., Эбель С., Энгельман Д. М., Флотенмейер М., Джусти Ф., Гохон И., Хонг В. Амфиполы: полимерные поверхностно-активные вещества для исследования мембранной биологии. Cell Mol Life Sci. 2003, 60 (8): 1559-1574. 10.1007 / s00018-003-3169-6.

Артикул Google ученый

22.

Tribet C, Audebert R, Popot JL: Амфиполы: полимеры, которые сохраняют растворимость мембранных белков в водных растворах.Proc Natl Acad Sci USA. 1996, 93 (26): 15047-15050. 10.1073 / pnas.93.26.15047.

Артикул Google ученый

23.

Горцелле Б.М., Хоффман А.К., Киз М.Х., Грей Д.Н., Рэй Д.Г., Сандерс К.Р.: Амфиполы могут поддерживать активность мембранного фермента. J Am Chem Soc. 2002, 124 (39): 11594-11595. 10.1021 / ja027051b.

Артикул Google ученый

24.

Althoff T, Mills DJ, Popot JL, Kuhlbrandt W: Расположение компонентов цепи переноса электронов в суперкомплексе митохондрий крупного рогатого скота I1III2IV1.EMBO J. 2011, 30 (22): 4652-4664. 10.1038 / emboj.2011.324.

Артикул Google ученый

25.

Орвик М.С., судья П.Дж., Прочек Дж., Линдхольм Л., Гразиадей А., Энгель А., Гробнер Г., Уоттс А. Образование без детергентов и физико-химические характеристики наноразмерных комплексов липид-полимер: Lipodisq. Angew Chem Int Ed Engl. 2012, 51 (19): 4653-4657. 10.1002 / anie.201201355.

Артикул Google ученый

26.

Орвик-Ридмарк М., Ловетт Дж., Гразиадей А., Линдхольм Л., Хикс М. Р., Уоттс А. Включение семистрансмембранного рецепторного белка без детергентов в наноразмерные двухслойные частицы Lipodisq для функциональных и биофизических исследований. Nano Lett. 2012, 12 (9): 4687-4692. 10.1021 / нл3020395.

Артикул Google ученый

27.

Ноулз Т.Дж., Финка Р., Смит С., Лин Ю.П., Даффорн Т., Овердуин М: мембранные белки, солюбилизированные в неизменном виде в липиде, содержащем наночастицы, связанные сополимером стирола и малеиновой кислоты.J Am Chem Soc. 2009, 131 (22): 7484-7485. 10.1021 / ja810046q.

Артикул Google ученый

28.

Ольха Н.Н.: Биогенез липидов и белков в биологических мембранах. Строение биологических мембран. Под редакцией: Yeagle PL. 2011, Нью-Йорк: CRC Press, 315-377. Третий

Google ученый

29.

Baracca A, Sgarbi G, Solaini G, Lenaz G: Родамин 123 как зонд митохондриального мембранного потенциала: оценка потока протонов через F (0) во время синтеза АТФ.Biochim Biophys Acta. 2003, 1606 (1-3): 137-146.

Артикул Google ученый

30.

Floryk D, Houstek J: Метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) подходит для цитофлуориметрических измерений потенциала митохондриальной мембраны в клетках, обработанных дигитонином. Biosci Rep. 1999, 19 (1): 27-34. 10.1023 / А: 10201934.

Артикул Google ученый

31.

О’Рейли С.М., Фогарти К.Э., Драммонд Р.М., Тафт Р.А., Уолш Дж. В.: Количественный анализ спонтанной деполяризации митохондрий.Biophys J. 2003, 85 (5): 3350-3357. 10.1016 / S0006-3495 (03) 74754-7.

Артикул Google ученый

32.

Райзингер В., Эйхакер Л.А.: Солюбилизация комплексов мембранных белков для синего нативного ПААГ. J Proteomics. 2008, 71 (3): 277-283. 10.1016 / j.jprot.2008.05.004.

Артикул Google ученый

33.

Wittig I, Schagger H: Природные электрофоретические методы для определения межбелковых взаимодействий.Протеомика. 2009, 9 (23): 5214-5223. 10.1002 / pmic.200

1.

Артикул Google ученый

34.

Нийтманс Л.Г., Хендерсон Н.С., Холт И.Дж.: Электрофорез Blue Native для изучения митохондриальных и других белковых комплексов. Методы. 2002, 26 (4): 327-334. 10.1016 / S1046-2023 (02) 00038-5.

Артикул Google ученый

35.

Wittig I, Braun HP, Schagger H: Синяя исходная СТРАНИЦА.Nat Protoc. 2006, 1 (1): 418-428. 10.1038 / nprot.2006.62.

Артикул Google ученый

36.

Schagger H, von Jagow G: Нативный электрофорез синего цвета для выделения комплексов мембранных белков в ферментативно активной форме. Анальная биохимия. 1991, 199 (2): 223-231. 10.1016 / 0003-2697 (91)-А.

Артикул Google ученый

37.

Schagger H, Pfeiffer K: Суперкомплексы в дыхательных цепях митохондрий дрожжей и млекопитающих.EMBO J. 2000, 19 (8): 1777-1783. 10.1093 / emboj / 19.8.1777.

Артикул Google ученый

38.

Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, Tomizaki T, Yamaguchi H, Shinzawa-Itoh K, Nakashima R, Yaono R, Yoshikawa S: вся структура 13-субъединицы окисленной цитохром с-оксидазы при 2,8 A . Наука. 1996, 272 (5265): 1136-1144. 10.1126 / science.272.5265.1136.

Артикул Google ученый

39.

Marechal A, Meunier B, Lee D, Orengo C, Rich PR: Цитохром с оксидаза дрожжей: модельная система для изучения митохондриальных форм суперсемейства гем-медьоксидазы. Biochim Biophys Acta. 2012, 1817 (4): 620-628. 10.1016 / j.bbabio.2011.08.011.

Артикул Google ученый

40.

Капальди Р.А.: Структура и функция цитохром с оксидазы. Анну Рев Биохим. 1990, 59: 569-596. 10.1146 / annurev.bi.59.070190.003033.

Артикул Google ученый

41.

Мишель Х, Бер Дж, Харренга А, Каннт А: Цитохром с оксидаза: структура и спектроскопия. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1998, 27: 329-356. 10.1146 / annurev.biophys.27.1.329.

Артикул Google ученый

42.

van Gelder BF: О цитохром с оксидазе. I. Коэффициенты экстинкции цитохрома а и цитохрома а3. Biochim Biophys Acta. 1966, 118 (1): 36-46. 10.1016 / S0926-6593 (66) 80142-Х.

Артикул Google ученый

43.

Монж С., Беро Н., Кузнецов А.В., Ростовцева Т., Сакетт Д., Шлаттнер Ю., Венделин М., Сакс В.А.: Регуляция дыхания в митохондриях и синаптосомах мозга: ограничения диффузии АДФ in situ, роли тубулина и митохондриальной креатинкиназы. Mol Cell Biochem. 2008, 318 (1-2): 147-165.

Артикул Google ученый

44.

Шаггер Х., Пфайффер К. Соотношение комплексов окислительного фосфорилирования I-V в митохондриях сердца крупного рогатого скота и состав суперкомплексов дыхательной цепи.J Biol Chem. 2001, 276 (41): 37861-37867.

Google ученый

45.

Даум G, Bohni PC, Schatz G: Импорт белков в митохондрии. Цитохром b2 и цитохром с пероксидаза расположены в межмембранном пространстве митохондрий дрожжей. J Biol Chem. 1982, 257 (21): 13028-13033.

Google ученый

46.

Zinser E, Daum G: Выделение и биохимическая характеристика органелл дрожжей.Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи. 1995, 11 (6): 493-536. 10.1002 / yea.320110602.

Артикул Google ученый

47.

Perry SW, Norman JP, Barbieri J, Brown EB, Gelbard HA: Зонды митохондриального мембранного потенциала и протонный градиент: руководство по практическому использованию. Биотехники. 2011, 50 (2): 98-115. 10.2144 / 000113610.

Артикул Google ученый

48.

Lemaire C, Dujardin G: Получение комплексов дыхательной цепи из митохондрий дикого типа и мутантных Saccharomyces cerevisiae: измерение активности и анализ субъединичного состава.Методы Мол биол. 2008, 432: 65-81. 10.1007 / 978-1-59745-028-7_5.

Артикул Google ученый

49.

Spinazzi M, Casarin A, Pertegato V, Salviati L, Angelini C: Оценка ферментативной активности митохондриальной дыхательной цепи на тканях и культивируемых клетках. Nat Protoc. 2012, 7 (6): 1235-1246. 10.1038 / nprot.2012.058.

Артикул Google ученый

50.

Ваден Д.Л., Гохил В.М., Гу З., Гринберг М.Л.: Разделение дрожжевых фосфолипидов с использованием одномерной тонкослойной хроматографии.Анальная биохимия. 2005, 338 (1): 162-164. 10.1016 / j.ab.2004.11.020.

Артикул Google ученый

51.

Dittmer JC, Lester RL: простой специальный спрей для обнаружения фосфолипидов на тонкослойных хроматограммах. J Lipid Res. 1964, 15: 126-127.

Google ученый

Эффективное профилирование мембранного протеома с помощью детергента у цианобактерий

Aivaliotis M, Karas M, Tsiotis G (2007) Альтернативная стратегия анализа протеома мембраны зеленой серной бактерии Chlorobium tepidum с использованием синего нативного PAGE и 2 -D PAGE на очищенных мембранах.J Proteome Res 6: 1048–1058

CAS Статья Google ученый

Alberte RS, Thornber JP (1978) Быстрая процедура выделения реакционного центра фотосистемы I в высокообогащенной форме. FEBS Lett 91: 126–130

CAS Статья Google ученый

Чен Э.И., Кочорва Д., Норрис Дж. Л., Йейтс Дж. Р. III (2007) Оптимизация поверхностно-активных веществ, совместимых с масс-спектрометрией, для протеомики дробовика.J Proteome Res 6: 2529–2538

CAS Статья Google ученый

Choi JS, Kim DS, Lee J, Kim SJ, Kim SI, Kim YH, Hong J, Yoo JS, Suh KH, Park YM (2000) Протеомный анализ светоиндуцированных белков у Synechocystis sp. PCC 6803: идентификация белков, разделенных методом 2D-PAGE, с использованием N-концевого секвенирования и MALDI-TOF MS. Mol Cells 10: 705–711

CAS Статья Google ученый

Choi CW, Yun SH, Kwon SO, Leem SH, Choi JS, Yun CY, Kim SI (2010) Анализ протеома цитоплазматической мембраны Streptococcus pneumonia с помощью протеомного подхода с дробовиком.J Microbiol 48: 872–876

CAS Статья Google ученый

Churchward MA, Butt RH, Lang JC, Hsu KK, Coorssen JR (2005) Усиленная экстракция детергента для анализа мембранного протеома с помощью двумерного гель-электрофореза. Proteome Sci 3: 5

Статья Google ученый

Gao L, Wang J, Ge H, Fang L, Zhang Y, Huang X, Wang Y (2015) К полному протеомуу Synechocystis sp.PCC 6803. Photosynth Res 126: 203–219

CAS Статья Google ученый

Глейзер А.Н., Уильямс Р.С., Яманака Г., Шачман Х.К. (1979) Характеристика фикобилисом цианобактерий в цвиттерионных детергентах. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 6162–6166

CAS Статья Google ученый

Han DK, Eng J, Zhou H, Aebersold R (2001) Количественное профилирование микросомальных белков, индуцированных дифференцировкой, с использованием изотопно-кодированных аффинных меток и масс-спектрометрии.Nat Biotechnol 19: 946–951

CAS Статья Google ученый

Huang F, Parmryd I, Nilsson F, Persson AL, Pakrasi HB, Andersson B, Norling B (2002) Протеомика Synechocystis sp, штамм PCC 6803: идентификация белков плазматической мембраны. Mol Cell Proteomics 1: 956–966

CAS Статья Google ученый

Huang F, Hedman E, Funk C, Kieselbach T, Schroder WP, Norling B (2004) Изоляция внешней мембраны Synechocystis sp.PCC 6803 и его протеомная характеристика. Mol Cell Proteomics 3: 586–595

CAS Статья Google ученый

Ishihama Y, Oda Y, Tabata T, Sato T, Nagasu T, Rappsilber J, Mann M (2005) Экспоненциально модифицированный индекс обилия белка (emPAI) для оценки абсолютного количества белка в протеомике по количеству секвенированных пептидов на белок. Протеомика клеток Mol 4: 1265–1272

CAS Статья Google ученый

Kwon J, Oh J, Park C, Cho K, Kim SI, Kim S, Lee S, Bhak J, Norling B, Choi JS (2010) Систематический анализ протеома цианобактериальных мембран путем комбинирования кислотного гидролиза и пищеварительных ферментов с наночастицами. -жидкостная хроматография-масс-спектрометрия с преобразованием Фурье.J Chromatogr A 1217: 285–293

CAS Статья Google ученый

Lee DG, Kwon J, Eom CY, Kang YM, Roh SW, Lee KB, Choi JS (2015) Направленный анализ фосфопротеома мембраны цианобактерий с использованием окрашенных фосфопротеинов и фосфопептидов, обогащенных титаном. J Microbiol 53: 279–287

CAS Статья Google ученый

Lin Y, Lin H, Liu Z, Wang K, Yan Y (2014) Улучшение метода подготовки проб с помощью дезоксихолата натрия для протеомики мембран дробовика на основе масс-спектрометрии.J Sep Sci 37: 3321–3329

CAS Статья Google ученый

Lin Y, Wang K, Liu Z, Lin H, Yu L (2015) Улучшенное расщепление с помощью SDC в сочетании с тандемной масс-спектрометрией липидной хроматографии для анализа мембранного протеома методом дробовика. J Chromatogr B 1002: 144–151

CAS Статья Google ученый

Loo RR, Cavalcoli JD, VanBogelen RA, Mitchell C, Loo JA, Moldover B, Andrews PC (2001) Виртуальный 2-мерный гель-электрофорез: визуализация и анализ E.coli методом масс-спектрометрии. Anal Chem 73: 4063–4070

CAS Статья Google ученый

Markwell JP, Thornber JP (1982) Обработка тилакоидной мембраны сурфактантом. Proc Natl Acad Sci U S A 70: 633–636

CAS Google ученый

Masuda T, Tomita M, Ishihama Y (2008) Расщепление трипсином с помощью поверхностно-активного вещества с фазовым переносом для анализа мембранного протеома.J Proteome Res 7: 731–740

CAS Статья Google ученый

Nagaraj N, Lu A, Mann M, Wisniewski JR (2008) Метод на основе детергентов, но без геля позволяет идентифицировать несколько сотен мембранных белков за один цикл ЖХ-МС. J Proteome Res 11: 5028–5032

Статья Google ученый

Накамура Ю., Канеко Т., Хиросава М., Миядзима Н., Табата С. (1998) CyanoBase, база данных www, содержащая полную нуклеотидную последовательность генома Synechocystis sp.Штамм PCC6803. Nucleic Acids Res 26: 63–67

CAS Статья Google ученый

Норрис Дж. Л., Портер Н. А., Каприоли Р. М. (2003) Масс-спектрометрия внутриклеточных и мембранных белков с использованием расщепляемых детергентов. Anal Chem 75: 6642–6647

CAS Статья Google ученый

Nothwang HG, Schindler J (2009) Двумерное разделение мембранных белков с помощью 16-BAC-SDS-PAGE.Методы Mol Biol 528: 269–277

CAS Статья Google ученый

Paggi RA, Gimenez MI, de Castro RE, Cesari A (2014) Простой метод повышения разрешения мембранных кислых белков галоархей Haloferax volcanii с помощью 2D-электрофореза. Электрофорез 35: 3518–3522

CAS Статья Google ученый

Peterson GL (1977) Упрощение метода анализа протеина Lowry et al.что более широко применимо. Анальная биохимия 83: 346–356

CAS Статья Google ученый

Писарева Т., Квон Дж., О Дж, Ким С., Дж. К., Висландер А., Чой Дж. С., Норлинг Б. (2011) Модель мембранной организации и сортировки белков в цианобактериях Synechocystis sp. PCC 6803, полученный на основе протеомики и многомерного анализа последовательностей. J Proteome Res 10: 3617–3631

CAS Статья Google ученый

Prasannavadhana A, Kumar S, Thomas P, Sarangi LN, Gupta SK, Priyadarshini A, Nagaleekar VK, Singh VP (2014) Анализ протеома внешней мембраны индийского штамма Pasteurella multocida серотипа B: 2 по MALDI-TOF / МС анализ.Научный мир J 2014: 617034

CAS Статья Google ученый

Сазука Т., Охара О. (1997) К протеомному проекту цианобактерии Synechocystis sp. Штамм PCC6803: связывание 130 белковых пятен с соответствующими генами. Электрофорез 18: 1252–1258

CAS Статья Google ученый

Schluesener D, Fischer F, Kruip J, Rögner M, Poetsch A (2005) Картирование мембранного протеома Corynebacterium glutamicum .Протеомика 5: 1317–1330

CAS Статья Google ученый

Седдон А.М., Курноу П., Бут П.Дж. (2004) Мембранные белки, липиды и детергенты: не только мыльная опера. Biochim Biophys Acta 1666: 105–117

CAS Статья Google ученый

Thornber JP, Alberte RS (1976) Хлорофилл-белки: мембранные фоторецепторные комплексы в растениях. В: Martonosi A (ed) Ферменты биологических мембран.Plenum Press, New York, pp 163–190

Chapter Google ученый

Vit O, Petrak J (2017) Интегральные мембранные белки в протеоимках.