A qc er: Facebook – log in or sign up

Содержание

Фэйсбук сжигает книги | Digital Russia

Гоголь

Сообщение о том, что фэйсбук забанил незнакомого мне писателя за словосочетание «несчастные хохлы»,  удивило сильно. Даже не поверилось в закономерность произошедшего. Мало ли, подумал я, кому не случается сделать глупость, вот, сделал её и фэйсбук, ну не может же быть, чтобы глупость в штабе фэйсбука была системным явлением.

Чтобы проверить, написал вот это:

Затем тут же, на глазах фэйсбучных цензоров, вступил в сговор с украинской (для вящей чистоты эксперимента – уж если протестовать против «хохол глупее вороны», так с территории братской страны) коллегой и инициировал её жалобу на Гоголя, Даля и Марка Твена. Коллега согласилась, правда, на Даля стучать не стала, предпочла избрать жертвой доноса Марка Твена за «негра». Ну, и на том спасибо, причём большое – человек хотя и символически, но всё же рисковал репутацией.

Результат поначалу обнадёживал. Больше суток фэйсбучная цензура безмолвствовала, и я уж было решил, что к Марку Твену у неё претензий нет. Оказалось, есть.

Обратился за разъяснениями к Екатерине Скоробогатовой, она в России – точка входа в фэйсбук для журналиста. Ответа не получил, что нормально (сверился по поводу диагноза «нормально» с Юрием Синодовым, он в этих делах дока).

Что же теперь делать? Пуститься в объяснения того, насколько это смешно? Но мне, во-первых, не смешно. А во-вторых, и это главное, объяснять что-либо этим некультурным (абсолютно точный термин, буквально) людям бессмысленно. Их надо высмеивать, с ними надо бороться. Они опасны. То, что они сделали, есть сетевое аутодафе. Сожжение книг, в чистом виде, причём каких книг! Петабайты фэйсбучной болтовни не стоят одного абзаца Гоголя, это не аллегория, а строгое утверждение (доказательство опускаю за очевидностью).

Но кое-что сказать всё же надо.

Это не первая бестактная попытка поправить русский язык, предпринятая транснациональной IT-компанией. Предшественником записавшегося в непрошенные цензоры фэйсбука была Microsoft – спелчекер Word 2007 считал слова «голубой», «негр», «жид» и др. нелегалами, незаконно пробравшимся в наши словари, и подчёркивал их красным. Но к этому можно было отнестись с иронией, и об этом журналисту без проблем можно было поговорить с главой Microsoft в России (Биргер Стен – среди языков, которыми он владеет, есть и русский), и история оказалась обратима – этот текст я набираю в Word из Office365, где всё уже в порядке.

Иное дело нынешняя фейсбук-инквизиция. Здесь мы имеем отнюдь не курьёзное, а вполне наглое посягательство на культуру. Не имеет значения, по какой причине фейсбук жжёт Гоголя, Даля и Марка Твена. Значение имеет то, что это мракобесие сродни мракобесию нацистскому или средневековому. Книги жечь нельзя, будь это даже «Молот ведьм» или «Майн кампф». Нельзя, и точка. Из самых общих соображений. Можно ограничить их распространение, но как именно ограничить – это уж точно не фэйсбуково дело.

Важнейший вопрос в этой истории: почему фэйсбук запрещает цитировать Гоголя, Марка Твена и Даля? Что он, собственно, имеет в виду? Достоверный ответ нам не дали, придётся самим сформулировать правдоподобные предположения.

Почему Facebook запрещает цитировать Гоголя, Марка Твена и Даля: таблица вариантов с экспертной оценкой правдоподобия

№ ппВозможная причинаОценка правдоподобия (число в диапазоне 0..1)
1Администрация фэйсбука страшно боится калифорнийского Роскомнадзора, который только и делает, что мониторит русскоязычные страницы на предмет поиска «негр», «хохол», «обама дурак», после чего шлёт предписания об устранении под страхом внесения fb.com в чёрный список0,01
2Это диверсия. Павел Дуров – резидент «ВКонтакте» в Сан-Фран – внедрил в фэйсбук свою агентуру, которая всячески вредит имиджу компании0,02
3Произвол на местах. Фэйсбучный цензор – сотрудник низшей категории, глупый и необразованный0,5
4Великодержавная USA-спесь, наивная вера в универсальность официальных американских представлений о прекрасном10Е-146 (такого просто не может быть)
5Кое-что похуже. Локальная операция информационной войны. Если отвратить аборигенов от Гоголя, им можно будет впарить побольше Стивена Кинга0,7

Вариант 5 выиграл наш хит-парад по единственной причине: он даёт пусть и глупое, зато рациональное обоснование поведения администрации фэйсбука в отношении классиков. Не дураки же там сидят, в самом деле, какой-то смысл в их действиях должен быть.

Коллаж D-Russia.ru. Использованы следующие источники: портрет В. И. Даля (В. Г. Перов, 1872 г.), портрет Н. В. Гоголя (Ф. Моллер, 1841 г.), портрет Марка Твена (Игнасиа Спиридон, 1898 г.), фотография Марка Цукерберга (Reuters/Stephen Lam).

Фэйсбук заманивает СМИ на свою платформу не только рекламой, но теперь еще и подпиской

После консультаций с сотнями СМИ, Facebook объявил в июле о планах создать механизм подписки на статьи в своем приложении Instant Article. Формат Instant Article появился в 2015 году. Он позволял людям читать статьи СМИ прямо в Facebook, не переходя на сайты изданий. Статья на Instant Article  загружается в 10 раз быстрее, чем при переходе по ссылке на сайт издания (0,8 секунд против 8 секунд). Кроме того, алгоритм Facebook позволяет показывать пользователям статьи на основании анализа их интересов и предпочтений. При этом Facebook обещал делиться со СМИ рекламными доходами (70%), сгенерированными на этом трафике.

Перед СМИ в очередной раз встала дилемма: отдавать свой контент и связь с аудиторией Facebook в обмен на трафик и обещания рекламных денег или все же развивать собственные площадки, которые позволяют ощущать читателя напрямую, но не дают такого трафика, как социальная сеть. Через два года стало понятно, что сатанинский соблазн доступа к огромной аудитории все же не сработал. Guardian и New York Times, которые первыми опробовали Instant Article, отказались от него в пользу собственных платформ. За ними последовали Bloomberg, Wall Street Journal, Forbes, NPR, Financial Times, Hearst, ESPN и CBS News. Выветривание контента оказалось существенным, а рекламные доходы – пустячными, не говоря уж об утрате прямого контакта с аудиторией. В общем, похоже, Instant Article не поплыл (хотя многим русскоязычным изданиям он все еще нравится).

Почувствовав, что СМИ упираются, Facebook сделал следующий шаг. Он решил подкупить редакции не только обещанием рекламы, но и подписки. С октября на базе той же Instant Article будут запущены тестовые механизмы платной подписки. То есть, если редакция хочет огородить свой контент пэйволом, то она сможет сделать это и в Facebook. Кроме того, редакциям обещано предоставлять всю метрику по аудитории (потеря читательских данных была одним из опасений СМИ).

Стоит, однако, обратить внимание, что дружеская инициатива Фэйсбука предложена на фоне бунта американских СМИ. Они обратились к Конгрессу США с просьбой сделать исключение из антитрастового законодательства и разрешить им коллективное выступление против Фэйсбука и Гугла, которые используют их контент без вознаграждения. Объединившись под эгидой News Media Alliance, отраслевого профсоюза, газеты и прочие СМИ, если разрешит конгресс, смогут начать коллективный торг с могулами интернета, возможно даже в суде. А это гораздо серьезнее, чем недовольство отдельных СМИ, даже самых влиятельных. СМИ уже окрестили возможное совместное выступление своей последней битвой за цифровую территорию.

%d0%a4%d1%8d%d0%b9%d1%81%d0%b1%d1%83%d0%ba на турецкий — Русский-Турецкий

Расчет 81, скорая всё ещё на переезде.

81. Müdahale Aracı, ambulans hâlâ trenin arkasında.

OpenSubtitles2018.v3

Расчет 81, Спасатель 3,

81 nolu müdahale aracı, 3.

OpenSubtitles2018.v3

В настоящий 83-й год правления Царства, возглавляемого Иисусом, некоторые, возможно, думают, что сейчас как раз период замедления.

İsa’nın Gökteki Krallık yönetiminin 83. yılında bulunduğumuzdan, bazıları şimdi gecikme döneminde olduğumuzu düşünebilir.

jw2019

Похоже, мы можем поехать по шоссе 81 и дальше через Даллас.

Bu 81 numaralı yoldan devam edip Dallas’a gidebiliriz gibi görünüyor.

OpenSubtitles2018.v3

Из них 81 человек был 65 лет и старше.

Onlardan 81i de 65’inin üzerindeydi.

jw2019

81, несите огнетушители.

81, söndürme kısmı sizde.

OpenSubtitles2018.v3

MBI нашла 83 процента.

MBI %83’ünü tespit etti.

ted2019

Как вам известно, Эль- Ниньо 1982- 83 годов погубило 95 процентов всех кораллов на Галапагосах.

Ama az önce öğrendiğiniz gibi 1982- 1983 ́te olan El Nino, Galapagos’taki mercanların% 95 ́ini öldürdü.

QED

Расчёт 81 центральной.

OpenSubtitles2018.v3

(Воспользуйся вопросником «Твой гардероб» на страницах 82 и 83.)

(Özdeyişler 15:22; 82 ve 83. sayfadaki “Gardırop Değerlendirmesi” çizelgesini kullan.)

jw2019

Те, кто полагаются на Иегову, «приходят от силы в силу» (Псалом 83

:6, 8).

Gücünü Yehova’dan alan kişiler “gittikçe kuvvetlenir.”

jw2019

Расчёт 81, выезжаем.

Müdahale Aracı 81 destek veriyor.

OpenSubtitles2018.v3

83:12). Происходит ли подобное в наши дни?

83:12). Günümüzde de benzer bir şey oldu mu?

jw2019

83:4 — Почему здесь упоминаются птицы?

84:3—Burada neden kuşlardan söz edilir?

jw2019

Число найденных шаровых скоплений продолжало расти, достигнув 83 единиц к 1915 году, 93 — к 1930 году и 97 — к 1947 году.

Keşfedilen küresel yıldız kümesi sayısı gittikçe artmaya devam etti, 1915’te 83’e ulaştı, 1930’da 93’ye ulaştı ve 1947 yılı itibarıyla 97’ye ulaştı.

WikiMatrix

Об этом императоре говорили, что в последние три года своего правления, длившегося с 81 по 96 год н. э., он действовал как безумный.

Bu imparatorun MS 81’den 96’ya kadar süren saltanatının son üç yılında çılgınca terör estirdiği söylenir.

jw2019

Желаю лучше быть у порога в доме Божием, нежели жить в шатрах нечестия» (Псалом 83:11).

Kötülük çadırlarında oturmaktansa, Allahın evinde eşikte durmak benim için iyidir.”

jw2019

Поясняя записанное в Коране 2:81 (87), ал-Байда̄вӣ сказал в своих знаменитых комментариях, что Иисус «воскрешал мертвых с помощью величайшего имени Бога».

(Yuhanna 17:6, 26) Ünlü Kurʹan tefsirinde Beyzavî, Kurʹan’ın 2. Suresinin (Bakara Suresi) 87. ayetinin yorumunda, İsa’nın “ölü kimseleri Allahın en büyük ismi ile yeniden hayata getirdiğini” söyler.

jw2019

83 1 Грамотное чтение

jw2019

Они чтят Божье имя (Псалом 83:18).

Onlar Tanrı’nın ismini yüceltirler (Mezmur 83:18).

jw2019

Перемножаем их и получаем 0. 81

Bu ikisini çarptığımızda 0, 81 eder.

QED

Вскоре ее муж и дочь тоже начали изучать Библию (Псалом 83:18; Луки 22:41, 42).

Kısa süre sonra eşi ve kızı da Kutsal Kitabı incelemeye başladı (Mezmur 83:18; Luka 22:41, 42).

jw2019

«Чтобы люди знали, что ты, чье имя Иегова, Ты один Всевышний над всей землей» (Псалом 83:18).

“İnsanlar bilsin ki, adı Yehova olan Sen, bütün yeryüzü üzerinde yalnız Sen Yücesin” (Mezmur 83:18).

jw2019

Скорая 61, расчёт 81, спасатель 3.

Ambulans 61, Kamyon 81, Manga 3.

OpenSubtitles2018.v3

Это первая кость — D1.

QED

почему не стоит вести бизнес в Facebook — Соцсети на vc.ru

Две недели назад Facebook без объяснения причин заблокировал несколько аккаунтов и попросил загрузить документы, удостоверяющие личность. Не совсем понятно, к чему была эта просьба: после загрузки скан-копии паспорта с реальными именем и фотографией соцсеть все равно заблокировала аккаунты «без возможности восстановить».

{«id»:187563,»url»:»https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook»,»title»:»\u0417\u0430\u0431\u0443\u0434\u044c\u0442\u0435 \u043e \u043f\u0440\u0430\u0432\u0430\u0445 \u0438 \u0441\u043f\u0440\u0430\u0432\u0435\u0434\u043b\u0438\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438: \u043f\u043e\u0447\u0435\u043c\u0443 \u043d\u0435 \u0441\u0442\u043e\u0438\u0442 \u0432\u0435\u0441\u0442\u0438 \u0431\u0438\u0437\u043d\u0435\u0441 \u0432 Facebook»,»services»:{«facebook»:{«url»:»https:\/\/www.facebook.com\/sharer\/sharer.php?u=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook»,»short_name»:»FB»,»title»:»Facebook»,»width»:600,»height»:450},»vkontakte»:{«url»:»https:\/\/vk.com\/share.php?url=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook&title=\u0417\u0430\u0431\u0443\u0434\u044c\u0442\u0435 \u043e \u043f\u0440\u0430\u0432\u0430\u0445 \u0438 \u0441\u043f\u0440\u0430\u0432\u0435\u0434\u043b\u0438\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438: \u043f\u043e\u0447\u0435\u043c\u0443 \u043d\u0435 \u0441\u0442\u043e\u0438\u0442 \u0432\u0435\u0441\u0442\u0438 \u0431\u0438\u0437\u043d\u0435\u0441 \u0432 Facebook»,»short_name»:»VK»,»title»:»\u0412\u041a\u043e\u043d\u0442\u0430\u043a\u0442\u0435″,»width»:600,»height»:450},»twitter»:{«url»:»https:\/\/twitter.

com\/intent\/tweet?url=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook&text=\u0417\u0430\u0431\u0443\u0434\u044c\u0442\u0435 \u043e \u043f\u0440\u0430\u0432\u0430\u0445 \u0438 \u0441\u043f\u0440\u0430\u0432\u0435\u0434\u043b\u0438\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438: \u043f\u043e\u0447\u0435\u043c\u0443 \u043d\u0435 \u0441\u0442\u043e\u0438\u0442 \u0432\u0435\u0441\u0442\u0438 \u0431\u0438\u0437\u043d\u0435\u0441 \u0432 Facebook»,»short_name»:»TW»,»title»:»Twitter»,»width»:600,»height»:450},»telegram»:{«url»:»tg:\/\/msg_url?url=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook&text=\u0417\u0430\u0431\u0443\u0434\u044c\u0442\u0435 \u043e \u043f\u0440\u0430\u0432\u0430\u0445 \u0438 \u0441\u043f\u0440\u0430\u0432\u0435\u0434\u043b\u0438\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438: \u043f\u043e\u0447\u0435\u043c\u0443 \u043d\u0435 \u0441\u0442\u043e\u0438\u0442 \u0432\u0435\u0441\u0442\u0438 \u0431\u0438\u0437\u043d\u0435\u0441 \u0432 Facebook»,»short_name»:»TG»,»title»:»Telegram»,»width»:600,»height»:450},»odnoklassniki»:{«url»:»http:\/\/connect.ok.ru\/dk?st.cmd=WidgetSharePreview&service=odnoklassniki&st.shareUrl=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook»,»short_name»:»OK»,»title»:»\u041e\u0434\u043d\u043e\u043a\u043b\u0430\u0441\u0441\u043d\u0438\u043a\u0438″,»width»:600,»height»:450},»email»:{«url»:»mailto:?subject=\u0417\u0430\u0431\u0443\u0434\u044c\u0442\u0435 \u043e \u043f\u0440\u0430\u0432\u0430\u0445 \u0438 \u0441\u043f\u0440\u0430\u0432\u0435\u0434\u043b\u0438\u0432\u043e\u0441\u0442\u0438: \u043f\u043e\u0447\u0435\u043c\u0443 \u043d\u0435 \u0441\u0442\u043e\u0438\u0442 \u0432\u0435\u0441\u0442\u0438 \u0431\u0438\u0437\u043d\u0435\u0441 \u0432 Facebook&body=https:\/\/vc.ru\/social\/187563-zabudte-o-pravah-i-spravedlivosti-pochemu-ne-stoit-vesti-biznes-v-facebook»,»short_name»:»Email»,»title»:»\u041e\u0442\u043f\u0440\u0430\u0432\u0438\u0442\u044c \u043d\u0430 \u043f\u043e\u0447\u0442\u0443″,»width»:600,»height»:450}},»isFavorited»:false}

9072 просмотров

Скриншот при попытке войти в аккаунт

Возникло ощущение большой личной потери, чувство, будто что-то украли.

Но все можно пережить. Печальнее всего то, что из-за никем не объясненных действий несколько проектов, в которые вложили большие средства, буквально за минуту оказались фактически на стадии закрытия. И все потому, что администраторами групп этих проектов числились те самые несколько заблокированных аккаунтов.

Некоторые группы, такие как Naked Science (один из самых цитируемых и посещаемых научпоп-ресурсов на русском языке), остались без администраторов: то есть с резко ограниченным функционалом. Другие, а точнее — целая сеть групп одного большого проекта на 300 тысяч подписчиков, просто удалили в никуда, поскольку, кроме заблокированных админов, там и не было других администраторов.

У вас может возникнуть вопрос: отчего же в этих группах не было других администраторов? Отвечу: там было два администратора — и обоих Facebook заблокировал. Будь их трое — возможно, заблокировали бы всех троих. Да и потом, мы не были морально готовы к такому рейдерскому закрытию. Многие из вас предполагали, что соцсеть может вот так просто взять и удалить несколько очень крупных групп без возможности передачи прав на их администрирование другому члену команды?

Всем известна моя острая, критическая позиция в отношении «ВКонтакте». Но там подобный вопрос можно решить за несколько дней, а вот в случае Facebook это оказалось в принципе невозможно для обычного человека.

Не исключено, что мой личный аккаунт нарушали некоторые правила FB. Быть может, я написал что-то не то, воспользовался не тем сервисом — или жаловались на меня слишком часто. Последнее допустимо, учитывая мою активность в дни войны в Нагорном Карабахе. Но ведь это не причина фактически убивать проект, к которому ты и личный аккаунт могут иметь отношение лишь отчасти! Особенно учитывая то, что сам проект и его аккаунт не противоречили правилам соцсети.

Пример моего поста в Facebook на моей личной странице. Пост не связан с группами, которые в итоге пострадали. Быть может Азербайджанское лобби так пытается бороться? 

Еще раз повторюсь: я не исключаю, что что-то нарушил. Вопрос лишь в том, почему Facebook из-за этого убивает целый проект(ы), просто удалив группы, а другую часть групп оставляет без администрирования? И все это без банальной функции передачи прав администратора хотя бы доверенному лицу, указанному в профиле. Как если бы за переход дороги на красный свет или другое мелкое правонарушение, совершенное мною лично, суд вдруг решил, помимо штрафа мне, закрыть проект, в котором я работаю.

Если сложить все написанные буквы в одну фразу, выйдет следующее: Facebook — недопустимо ненадежная площадка для развития бизнеса. Здесь нет никаких гарантий, что даже в группе с десятью администраторами их всех не переблокируют. Причем так, что у тебя не будет даже возможности узнать причину. А попытки связаться с технической поддержкой всеми мыслимыми и немыслимыми способами останутся без ответа — или, что еще хуже, на них ответит бот с шаблонной «рекомендацией» обратиться в раздел помощи.

Ответы на обращения по всем доступным каналам связи. Писал на двух языках, с разных аккаунтов. 

Замечу, что проблема, мягко говоря, не новая. Цензура и блокировки, с которыми масса людей сталкиваются в соцсетях, набирают все большие обороты. Проблема поднималась раньше и на vc.ru(статья 1, статья 2, статья 3), и множестве других площадок. Например, было много блокировок инстаграм-аккаунтов. Но их, впрочем, можно разблокировать — за деньги и через специальных людей, если ты не простой смертный.

И насчет «стирания личности» я не то чтобы ошибаюсь. Мы живем в эпоху, когда многие работодатели, прежде чем «подписать» тебя в сотрудники, смотрят, кто ты и что ты, в том числе изучая профили в соцсетях. Люди, естественно, учитывают это и на протяжении долгих лет оформляют свои аккаунты в Сети соответствующим образом. Пишут посты, строят социальные связи, тщательно выбирают тематику того, о чем постят, и делают многое-многое другое.

Но «стирание цифровой личности» при удалении FB-аккаунта не ограничивается тем, что тебе внезапно больше нечего показать работодателю (хотя и это плохо, если ты работаешь в СМИ или публичной отрасли). Есть и другие проблемы. На некоторые сайты можно зайти только через профиль Facebook — или же через него это просто удобнее всего сделать. В итоге после «бессудной» блокировки пропадает не только твоя страница в соцсети, но и твой профиль, например, на vc.ru. А ведь там могут быть собраны все твои комментарии, закладки и статьи. Все это просто исчезает, а Facebook наплевать.

После этого возникает чувство, будто тебе вынесли приговор в суде и лишили имущества, а ты даже не знаешь, за что и почему. Людей с подобными историями уже тысячи. Это настоящий террор крупного монополиста, с которым нужно что-то делать.

Прошли почти две недели с момента блокировки. Потыкавшись — десятки раз! — в наглухо закрытые двери, мы фактически лишились всяких надежд вернуть себе стертые группы. В результате, скорее всего, придется закрыть первый в Армении агрегатор новостей Echo.am — проект, в который вложили большие деньги. Ведь любой подобный сайт не может функционировать без трафика, а в силу специфики рынка существенная часть просмотров на все новостные проекты шла как раз из Facebook.

Как снизился трафик из Facebook после блокировки. Проекту было всего несколько месяцев, прямых заходов и из других источников почти не было. Всего за несколько месяцев была собрана большая аудитория за счет рекламы на самой платформе. 

В некоторых других проектах по чистой случайности были редакторы или другие администраторы, поэтому нам просто повезло не потерять хотя бы их. Группа Naked Science в Facebook, вероятно, тоже перестанет функционировать. Ведь там теперь фактически нет администратора — а редакторы, которых уже нельзя поменять или добавить, не будут вечно оставаться в проекте.

Надеюсь, мой опыт многим поможет определиться с приоритетами — и с тем, куда не стоит вкладывать деньги. Возможно, в качестве площадки для своей аудитории они выберут, например, Telegram (у нас там самое крупное научное СМИ на русском), где никогда не станут так нагло и беспардонно отнимать личное имущество (группы). Или хотя бы — при всей моей критике в его адрес — «ВКонтакте». Как бы то ни было, там в последнее время происходят позитивные сдвиги в отношении к администраторам. И да, там есть адекватная (жаль, что не всегда) техподдержка, которая может быстро решить острые вопросы.

Современный человек, или зачем нужен фэйсбук, если есть контакт и жж?

Если ты современный человек – у тебя обязательно есть фэйсбук. Это твоя основная площадка общения с окружающим миром. В фэйсбук ты пишешь свои умные мысли, здесь разговариваешь с друзьями, находишь нужные контакты, ищешь информацию по группам, в общем, живёшь полноценной жизнью.

Если ты современный человек – у тебя обязательно есть инстаграм. Туда ты постишь фоточки с путешествий, сэлфи с вечеринок, прогулок, жратву из ресторанов, ставишь жэштеги, лайкаешь фотки друзей.

Если ты современный человек – у тебя обязательно есть твиттер. Туда строчишь про всё, что видишь вокруг, что тебе приходит в голову 20 часов в сутки, кидаешь ссылки, ретвитишь посты друзей.

Если ты современный человек – твой основной мессенджер – вотсап. Там ты ведёшь всю деловую и дружескую переписку. Ту, конечно, что не попала в «телеграм».

Если ты современный человек, а ещё — продвинутый активный, то у тебя обязательно есть канал на ютуб, куда ты выкладываешь свои обращения миру и просто разные ролики.

Если ты современный человек и совсем крутой продвинутый активный – у тебя есть стрим-канал, где ты в реальном времени показываешь что идёшь, где ешь, куда какаешь и т.д.

Если ты современный человек, то ты уже не понимаешь, как можно жить без всего этого. Если у кого-то нет всего вышеперечисленного, значит его просто «нет». Все эти ресурсы установлены в виде приложений на твой модненький айфон последней или предпоследней модели с сверкающим чистотой экраном. Как ты успеваешь одновременно везде быть? Просто: для оперативного обновления всех этих средств, своевременного ответа на комменты, отслеживания ситуации тебе приходится с утра до вечера постоянно лазить в этот айфон, если вообще не вылезать изредка отвлекаясь на вопросы окружающих, постоянно их переспрашивая что они сказали. Какие-то друзья или родители недоумевают как можно так «пропадать» из реальной жизни, но что они поймут. У них то ничего этого нет, их, как бы, и не существует. Ты, конечно, на любой встрече, на любой тусовке и всегда в транспорте сидишь большую часть времени уткнувшись в свой гаджет, что, конечно же, может раздражать тех немногочисленных коллег, кто ещё не уткнулся в них точно также. Но зато весь мир может в реальном времени следить за тобой, оценить скушанный тобою стейк, поставить лайк твоему сэлфи, сделанному 3 минуты назад.


Если ты современный человек, то наверняка уже забросил свой «живой журнал» если он у тебя вообще когда-либо был. Это немодно, олдскульный дизайн и сервис, и вообще вся тусовка уже отсюда ушла. Ну и с твоего айфона немножко неудобно сюда постить фоточки и тексты, так как нет мобильного приложения. Живой журнал был обязательным атрибутом современного человека в нулевых – тогда практически у каждого основными каналами связи и были: e-mail, ICQ, skype, и аккаунт в Livejournal.

Если ты современный человек, то и «контакт» уже не особо жалуешь. Постишь туда изредка фоточки по инерции, чтобы не терять подписчиков, но он уже перестал быть твоим основным ареалом обитания.

Если ты современный человек, то слово «аська», зелёный цветочек с одним красным лепестком, равно как и звуковой сигнал «а-а» тебе говорит чуть менее, чем ни о чём. Если когда-то что-то такое и было в твоей жизни, то оно забыто начисто как страшный сон. Как кнопочный и стационарный телефон, а также как бумажные письма и открытки. И даже название твоего любимого мессенджера не ассоциируется у тебя со столь популярным в 20-м веке оперативным средством связи.

А я – несовременный человек. Всех вышеперечисленных атрибутов у меня нет или я практически не захожу в них. Завёл твиттер ещё 7 лет назад, но так и не навострился им пользоваться – мои мысли не вмещаются никак в 140 символов, а система комментирования и ретвитов недоступна моему сознанию. Фэйсбук традиционно был отдан на откуп жене, хотя я недавно там обжился чтобы вести избирательную кампанию. А инстаграм вообще не воспринимается мной, хоть тоже зарегился там когда-то. Ютуб канал использую чисто в технических целях – грузить видюшки для экспорта сюда. Иногда, конечно, ощущаю психологический дискомфорт от того что где-то что-то происходит, а я в этом не участвую.

Навеяно это всё постом Тёмы. Из жж люди уходят и идут в фэйсбук. Уже многократно про это говорилилось, в т.ч. и здесь мы это обсуждали. Но я не представлял, что масштаб падения интереса к жж столь критичен: с 17 миллионов до 4..
Непонятно другое – почему альтернатива именно фэйсбук? Да, конечно, постов таких как у меня там не напишешь, но мысли свои и не слишком длинные тексты выставить можно. Но чем хуже тот же контактик. Вот уж скажу что поковырявшись в системе минут 15 с целью перенести некоторую информацию из группы с одного места в другое, постоянно вспоминал в отношении разработчиков фэйсбука вот эту плашку из легендарного луркмора:

Реально вымораживает как тут всё лезет, скачет мигает, куча непонятной информации по всем сторонам, постоянно этот фэйсбук кого-то в друзья тебе пытается пихать. Желание одно – поскорее закрыть и не пользоваться им больше. Вот, хотя бы, простая формочка отправки поста с кучей какого-то непонятного говна, сбивающего с толку.

Насколько же удобнее и эргономичнее контактик – ничего лишнего: одна менюшка и лента. Всё!
И вот почему все прут в этот неудобный фэйсбук? Я понимаю ещё украинцев, которых переводят туда принудительно, закрывая контакт, но остальные то? Зачем вам оно неудобное такое и неприкольное, а ещё и назойливое?

Впрочем, будем реалистами. Глупо пытаться запихать зубную пасту обратно в тюбик. Увы, сколько я не призывал вернуться всех в аську, что-то не хотят люди. Также и здесь: раз основной контингент пасётся там, то так или иначе придётся тоже идти туда, как бы оно не не нравилось. Чисто по прагматическим соображениям, по принципу работы всех соцсетей. Просто чтобы была возможность пересечься с людьми, которым это может быть интересно, но которых тут уже нет.

ПОДПИСАТЬСЯ НА ЖУРНАЛ

КАК ФЭЙСБУК БОРЕТСЯ С НАРУШИТЕЛЯМИ – Our Texas – Russian Newspaper in Houston, Dallas, San-Antonio, Austin, Texas

Самая популярная в мире социальная сеть Facebook опубликовала свой первый в этом году квартальный «модерационный отчет» (Moderation Report), в котором рассказала миру, сколько и каких фальшивых аккаунтов и запрещенных постов было удалено. После громких скандалов с российскими «ботофермами», влиявшими через эту сеть на выборы в Америке и европейских странах, после показательной «порки», которую пришлось выдержать Марку Цукербергу в стенах Капитолия, Facebook остро нуждается в демонстрации «антиспамовой» активности.

По его данным, лишь за первые три месяца 2018 года были приняты меры против 1,5 миллиардов текстов и аккаунтов по подозрению в нарушении правил пользования Facebook. Из отчета следует, что большая часть запретов и удалений была направлена против спам-рассылок и фальшивых аккаунтов (Fake-Accounts).

«ЭЛЕКТРОННЫЙ ЦЕНЗОР» В ДЕЙСТВИИ

Каков же результат этой бурной деятельности? По данным FB, которые приводит, в частности, британское издание «The Guardian», было удалено лишь спам-текстов целых 837 миллионов. Также были уничтожены 583 млн. фейковых аккаунтов. Кроме того, удалению подверглись: 2,5 млн. текстов, якобы направленных на так называемую «пропаганду ненависти», 1,9 млн. текстов, расцененных, как «террористическая пропаганда», 3,4 млн. текстов, распространявших призывы к насилию и 21 млн. текстов, содержащих порнографию или недозволенные сексуальные действия.

При этом было отмечено, что некоторые категории нарушений – такие, как распространение детской порнографии, реальные угрозы насильственных правонарушений, тексты о самоубийствах, моббинг и тому подобное – не были учтены, так как их было слишком мало, чтобы повлиять на общую статистику. Кроме того, FB сообщил, что большая часть модерации осуществляется при помощи искусственного интеллекта – то есть, автоматически. Алгоритмы, по его данным, помогли выявить 98,5% фейковых аккаунтов и почти 100% спама.

Победа на всех фронтах, не так ли? А за полгода все выглядит еще победнее: по данным Facebook, за последние полгода было удалено почти 1,3 млрд. фейковых аккаунтов (это при том, что общее количество аккаунтов а Фейсбуке составляет около 2,2 млрд.), причем 98% из них были перехвачены еще до того, как другие пользователи смогли их увидеть. За шесть месяцев были удалены почти 3 миллиона текстов, содержащих пропаганду терроризма. Ну, и по другим категориям – миллионы и миллионы…

Просто какой-то триумф искусственного «цензора». Боты, тролли и террористы убегают из сети, поджавши хвосты, и все становится прекрасно, спокойно и общечеловечно… На самом же деле, следует хотя бы понять, как именно трактует Фейсбук понятие «содержания». Например, если запись содержит текст и, скажем четыре фотографии под ним, то она расценивается, как пять «содержаний». Но, если удалена будет вся запись, она обозначается в статистике, как лишь одно «содержание».

Именно таким образом и получилось, что за прошлый квартал было удалено 2,5 млн. «содержаний», причем 38% из них Facebook заметил сам, с помощью так называемых «автоматических банхаммеров» – то есть, программ, просматривающих «содержания», в которые заложены ключевые «запрещенные» слова. Для сравнения: за последний квартал 2017 года таких «содержаний» нашлось 1,6 млн., из них 23,6% были замечены и удалены автоматически. То есть выходит – искусственный цензор развивается и учится, но Facebook подчеркивает, что в случае с «пропагандой ненависти» его все равно постоянно контролируют люди, чтобы иметь возможность избежать ошибок, исходя из контекста написанного.

ЭФФЕКТ МОСКАЛЯ

Нижайше прошу прощения за страшное журналистское преступление, которое только что совершил: а именно – никогда не писать статьи от первого лица, никогда не говорить «я» в материале. Мне пришлось это сделать, так как мое личное мнение: вся эта красивая статистика не стоит и выеденного яйца. Во-первых, потому что настоящие фейковые аккаунты в Фейсбуке, причиняющие вред – это активные аккаунты, они уже есть, их «кукловоды» что-то в них пишут, кого-то обливают грязью, продвигают какие-то политические лозунги – работа у них такая. Поэтому, если автомат удаляет пустой «законсервированный» аккаунт – это, конечно, тоже полезно, но это второстепенно и никак не влияет на вредоносную деятельность «ботоферм».

Во-вторых же, этот самый «человеческий контроль» за автоматическими системами как оборачивался, так и оборачивается против среднестатистических пользователей. Не знаю, как в других странах, но, скажем, украинцы об этом могут хоть песни петь – традиционные, народные, те самые, которые начинаются сплошь на «Ой!» Потому что «следящие специалисты» из ирландского офиса ФБ, скорее всего – не только русскоговорящие (то есть, те, кто считают, что «русский и украинский – это одно и то же»), а еще и, так сказать, «русскоштампные». Поэтому считают, например, нормальное украинское словечко «москаль» едва ли не матом, и, в любом случае – оскорблением по национальному признаку. Тот факт, что слово это означает российского солдата примерно так же, как «джи-ай» означает солдата американского, а «томми» – британского, им не известно, поэтому за упоминание, скажем, главы украинской Закарпатской областной госадминистрации Геннадия Москаля уже многих украинцев отправили прямиком в бан. Так же, как и за цитирование речи Петра Порошенко, в которой он сослался на стихи Владимира Маяковского: «Товарищ москаль! На Украину зубы не скаль!» Если, например, вынести слово «москаль» в заголовок этой статьи, то, пожалуй, ссылку на нее нельзя будет разместить в Фейсбуке, независимо от того, каково ее содержание. С легкой руки этих «знатоков» несчастный москаль попал в автоматический фейсбучный банхаммер и начал виртуально колошматить ни в чем не повинных людей не хуже, чем москали-настамнеты на Донбассе.

Таких примеров можно привести великое множество и, судя по тому, как неэффективно и даже вредоносно работает этот «искусственный интеллект» в украинском сегменте Фейсбука – можно экстраполировать эту неэффективность на сегменты других стран и других языков. Этой системе, как минимум, нужно еще долго усовершенствоваться и доходить до ума, прежде, чем кто-то выпустит ее на живых людей – но выпустили уже сейчас.

И в-третьих, сама мысль о том, что кто-то доводит до ума и усовершенствует систему, которую спокойно можно назвать «электронным цензором», заставляет серьезно переживать. Еще Альберт Эйнштейн призывал ученых «быть ответственными за свои открытия», а разработка подобной автоматической цензуры – вещь крайне опасная.

Методы рекрутирования: РЕКРУТИРОВАНИЕ В ФЭЙСБУК

КAК ТOЛЬКO ВЫ ПPИCOEДИНИТECЬ, ВAМ ПPИCВOЯТ PEГИCТPAЦИOННЫЙ НOМEP, НA НЁМ ФИКCИPУEТCЯ ВCЁ: КOЛИЧECТВO ЛЮДEЙ, ВAШ ДOХOД. 

ВAШA PAБOТA БУДEТ ЗAКЛЮЧAТЬCЯ: 

CДEЛAТЬ CТPAНИЧКY В КOНТAКТE, PEГИCТPAЦИOННYЮ CCЫЛКY И КAЖДЫЙ ДEНЬ OТПPAВЛЯТЬ ПPИГЛAШEНИЯ В ДPYЗЬЯ. ТEМ КТO ДOБAВИЛCЯ -OТПPAВЛЯТЬ ПPEДЛOЖEНИE O PAБOТE (ВCE ШAБЛOНЫ И ИНCТPYКЦИИ ПPEДOCТAВИМ). КТO ХOЧEТ — PEГИCТPИPYEТCЯ (ПO ВAШEЙ CCЫЛКE ПOД ВAШ НOМEP). ВOТ И ВCЯ PAБOТA. ЖEЛAЮЩИХ OЧEНЬ МНOГO, Y МEНЯ КAЖДЫЙ ДEНЬ PEГИCТPAЦИИ! НY EЩE CAМOЙ НAДO ПOЛЬЗOВAТЬCЯ ПPOДYКЦИEЙ, ЧТO-НИБYДЬ ПOКYПAТЬ, ХOТЯ БЫ ИНOГДA ШAМПYНЬ-ВCE PAВНO В МAГAЗИНE ПOКYПAEТE) ПPOДAВAТЬ НИЧEГO НE НAДO, И COБИPAТЬ ЗAКAЗЫ ТOЖE, КAЖДЫЙ В CТPYКТYPE ЗAКAЗЫВAEТ ПPOДYКЦИЮ CAМ ДЛЯ CEБЯ, ЧEPEЗ CВOЙ ЛИЧНЫЙ КAБИНEТ И ПO МEPE НEOБХOДИМOCТИ. 

OТКУДA ДOХOД: 

OТ ПOКУПOК ВAШEЙ CТPУКТУPЫ (ЛЮДEЙ КOТOPЫХ ВЫ ЗAPEГИCТPИPУEТE) ВЫ БУДEТE ПOЛУЧAТЬ OТ 3 ДO 22%. В CPEДНEМ, ДEВЧOНКИ В НAШEМ ПPOEКТE ЗAPAБAТЫВAЮТ 500$ (ЗA КAЖДЫЙ КAТAЛOГ, Т.E. КAЖДЫE ТPИ НEДEЛИ) УЖE ЧEPEЗ ПOЛГOДA PAБOТЫ. ДEВOЧКИ КOТOPЫE УЖE 1,5-2 ГOДA В ПPOEКТE ПOЛУЧAЮТ 75-120 ТЫC. КAЖДЫE ТPИ НEДEЛИ, И ЭТO НE ПPEДEЛ. CPAЗУ CКAЖУ, МЫ ИЩЕМ CЕPЬЕЗНЫХ ПAPТНЕPOВ, КOТOPЫЕ ДЕЙCТВИТЕЛЬНO ГOТOВЫ PAБOТAТЬ PAДИ PЕЗУЛЬТAТA. 

Я ВAМ БУДУ ПOМOГAТЬ: 

ПOCЛE ВAШEЙ PEГИCТPAЦИИ В ПPOEКТE ДAЛЬШE CВOИХ НOВИЧКOВ Я УЖE БУДУ PEГИCТPИPOВAТЬ ПOД ВAC, ВЫПOЛНЯЯ ЗA ВAC 30-50% PAБOТЫ. ЭТИ ЛЮДИ БУДУТ ПPИНOCИТЬ ВAМ ДOХOД ЧEPEЗ 7-10 МECЯЦEВ OТ 500ДOЛЛAPOВ И ДAЛЬШE, ПO МEPE УВEЛИЧEНИЯ CТPУКТУPЫ.  

ВЫ МOЖEТE ПPOЙТИ PEГИCТPAЦИЮ И ПOCМOТPEТЬ КAК ЭТO ВCE PAБOТAEТ. PEГИCТPAЦИЯ НA 3 МECЯЦA БECПЛAТНAЯ. ЗA ЭТO ВPEМЯ ВЫ ПOЙМЁТE CУТЬ. ECЛИ ВAМ ПOДOЙДЁТ- CДEЛAEТE ЗAКAЗ НA ЛЮБУЮ CУММУ ЧТOБЫ ПPOДЛИТЬ PEГИCТPAЦИЮ И OCТAНEТECЬ В ПPOEКТE, ECЛИ НEТ- НИЧEГO НE БУДEТE ДEЛAТЬ, В ЭТOМ CЛУЧAE ВAШA PEГИCТPAЦИЯ AННУЛИPУEТCЯ И ВCE ВAШИ ДAННЫE БУДУТ УДAЛEНЫ. 

ЭТО O R I F L A M E ОНЛАЙН, НО К ПРОДАЖАМ МЫ НЕ ИМЕЕМ НИКАКОГО ОТНОШЕНИЯ.

ЕСЛИ ХОТИТЕ ПРИСОЕДИНИТЬСЯ К ПРОЕКТУ ССЫЛКА НА РЕГИСТРАЦИЮ: ВАША ССЫЛКА НА РЕГИСТРАЦИЮ

(PDF) Контроль качества эндоплазматической сети

190 | МАРТ 2003 г. | ТОМ 4 www.nature.com/reviews/molcellbio

ОТЗЫВЫ

55. Ellgaard, L. et al. ЯМР-структура P-домена кальретикулина

. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 3133–3138

(2001).

56. Frickel, E.-M. и другие. TROSY-ЯМР выявляет взаимодействие

между ERp57 и кончиком P-домена кальретикулина.

Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 1954–1959 (2002).

57. Лич, М. Р., Коэн-Дойл, М. Ф., Томас, Д. Ю. и

Уильямс, Д. Б. Локализация лектина, связывание ERp57,

и сайты связывания полипептидов калнексина и кальретикулина.

J. Biol. Chem. 277, 29686–29697 (2002).

58. Jakob, C.A. et al. Htm1p, маннозидазоподобный белок,

участвует в деградации гликопротеинов у дрожжей. EMBO Rep.

2, 423–430 (2001).

59. Хосокава Н. и др. Новый ER-подобный α-маннозидазе белок

ускоряет ER-ассоциированную деградацию.EMBO

Rep. 2, 415–422 (2001).

Ссылки 58 и 59 описывают идентификацию

и характеристику нового лектина ER

(Htm1p / EDEM), который участвует в ERAD из

гликопротеинов.

60. Yoshida, Y. et al. Убиквитинлигаза E3, распознающая

сахарных цепей. Nature 418, 438–442 (2002).

Это исследование представляет доказательства того, что цитозольный

SCF

Fbx2

убиквитин-лигазный комплекс нацелен на ретрослоцированные гликопротеины

для протеасомной деградации

.

61. Caramelo, JJ, Castro, OA, Alonso, LG, De Prat-Gay, G.

и Parodi, AJ UDP-Glc: гликопротеин глюкозилтрансфераза

распознает структурированные и доступные для растворителя

гидрофобных пятен в расплавленных глобулах. вроде складной

промежуточных звена. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 86–91

(2003).

62. Тромбетта, Э. С. и Хелениус, А. Конформационные требования

для реглюкозилирования гликопротеинов в эндоплазматическом ретикулуме

.J. Cell Biol. 148, 1123–1129

(2000).

63. Риттер, К. и Хелениус, А. Распознавание локального гликопротеина

неправильная укладка с помощью сенсора сворачивания ER

UDP – глюкоза: гликопротеин глюкозилтрансфераза.

Nature Struct. Биол. 7. С. 278–280 (2000).

64. Браун, К. Р., Хонг-Браун, Л. К. и Велч, У. Дж.

Коррекция чувствительных к температуре дефектов сворачивания белков.

J. Clin. Вкладывать деньги. 99, 1432–1444 (1997).

65.Морелло, Дж. П., Петая-Репо, У. Э., Бишет, Д. Г. и Бувье, М.

Фармакологические шапероны: новый поворот в сворачивании рецептора

. Trends Pharmacol. Sci. 21. С. 466–469 (2000).

66. Petäjä-Repo, U. E. et al. Лиганды действуют как фармакологические шапероны

и повышают эффективность созревания рецептора δ-опиоида

. EMBO J. 21, 1628–1637 (2002).

Благоприятное влияние лигандов на созревание белка

и экспорт в ЭР δ опиоидных рецепторов

хорошо иллюстрирует функцию фармакологических шаперонов

.

67. Morello, J. P. et al. Фармакологические шапероны спасают

экспрессии на клеточной поверхности и функции неправильно свернутых мутантов рецептора вазопрессина V2

. J. Clin. Вкладывать деньги. 105,

887–895 (2000).

68. Halaban, R., Cheng, E., Svedine, S., Aron, R. & Hebert, DN

Правильная укладка и эндоплазматический ретикулум к гольджи

транспорт тирозиназы индуцируется ее субстратами,

DOPA и тирозин. J. Biol. Chem. 276, 11933–11938

(2001).

69. Лоо, Т. В. и Кларк, Д. М. Коррекция кинезиса дефектного белка

мутантов человеческого Р-гликопротеина с помощью субстратов

,

и модуляторов. J. Biol. Chem. 272, 709–712 (1997).

70. Винс, Г. Д., О’Хара, Т. и Риттенберг, М. Б. Восстановление секреции антител

с использованием гаптенового лиганда в качестве химического шаперона

. J. Biol. Chem. 276, 40933–40939

(2001).

71. Занотти, Г., Берни, Р. и Монако, Х. Л. Кристаллическая структура

,

лигандированных и нелигандированных форм бычьего плазмы, связывающего ретинол-

-связывающий белок.J. Biol. Chem. 268, 10728–10738 (1993).

72. Херрманн, Дж. М., Малкус, П. и Шекман, Р. Из

ER — экипировщики, сопровождающие и гиды. Trends Cell Biol. 9,

5–7 (1999).

73. Stamnes, MA, Shieh, BH, Chuman, L., Harris, GL &

Zuker, CS Гомологина циклофилина A представляет собой тканеспецифический интегральный мембранный белок

, необходимый для правильного синтеза

субпопуляции родопсинов дрозофилы. Cell 65,

219–227 (1991).

74. Bu, G. Роли рецептор-ассоциированного белка (RAP) как молекулярного шаперона

для членов семейства рецепторов ЛПНП

. Int. Rev. Cytol. 209, 79–116 (2001).

75. Nichols, W. C. et al. Мутации в белке промежуточного компартмента ER – Golgi

ERGIC-53 вызывают

комбинированный дефицит факторов свертывания крови V и VIII. Cell

93, 61–70 (1998).

76. Аппенцеллер, К., Андерссон, Х., Каппелер, Ф. и Хаури, Х.P.

Лектин ERGIC-53 — это грузовой транспортный рецептор для

гликопротеинов. Nature Cell Biol. 1. С. 330–334 (1999).

77. Стек, Т. и Ланге, Ю. SCAP, датчик ER, который регулирует уровень холестерина

клеток. Dev. Cell 3, 306–308 (2002).

78. Yang, T. et al. Решающий шаг в гомеостазе холестерина.

Стерины способствуют связыванию SCAP с INSIG-1, мембранным белком

, который способствует удержанию SREBP в

ER. Cell 110, 489–500 (2002).

79. Ябе, Д., Браун, М. С. и Голдштейн, Дж. Л. Insig-2, белок второго эндоплазматического ретикулума

, который связывает SCAP

и блокирует экспорт белков

, связывающих регуляторный элемент стерола. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12753–12758

(2002).

80. Тисдейл Р. Д. и Джексон М. Р. Сигнальная сортировка

мембранных белков между эндоплазматическим ретикулумом

и аппаратом Гольджи. Анну. Rev. Cell Dev.

Биол. 12. С. 27–54 (1996).

81. Хартер, К. и Виланд, Ф. Секреторный путь:

механизмов сортировки и транспорта белков. Биохим.

Biophys. Acta 1286, 75–93 (1996).

82. Munro, S. & Pelham, H.R. С-концевой сигнал предотвращает секрецию

белков ER просвета. Cell 48, 899–907 (1987).

83. Семенца, Дж. К., Хардвик, К. Г., Дин, Н. и Пелхэм, Х. Р.

ERD2, дрожжевой ген, необходимый для опосредованного рецептором

извлечения белков ER в просвете секреторного пути

.Cell 61, 1349–1357 (1990).

84. Пелхам, Х. Р. Использование сигналов сортировки для удержания белков в эндоплазматическом ретикулуме

. Методы Энзимол. 327, 279–283

(2000).

85. Нильссон Т., Джексон М. и Петерсон П. А. Короткие

цитоплазматические последовательности

служат в качестве сигналов удерживания для

трансмембранных белков

в эндоплазматическом ретикулуме.

Cell 58, 707–718 (1989).

86. Джексон М. Р., Нильссон Т. и Петерсон П. А. Идентификация

консенсусного мотива для удержания трансмембранных белков

в эндоплазматической сети.EMBO J. 9,

3153–3162 (1990).

87. Letourneur, F. et al. Коутомер необходим для извлечения

и

белков, меченных дилизином, в эндоплазматический ретикулум.

Cell 79, 1199–1207 (1994).

88. Пелхэм, Х. Р. О очереди для КС? Cell 79,

1125–1127 (1994).

89. Ма, Д. и Ян, Л. Y. Транспортные сигналы ER и транспортировка

калиевых каналов и рецепторов. Curr. Opin. Neurobiol.

12, 287–292 (2002).

90. О’Келли И., Батлер М. Х., Зильберберг Н. и Голдштейн С. А.

Прямой транспорт: связывание 14-3-3 преодолевает удержание в эндоплазматическом ретикулуме

с помощью двухосновных сигналов. Cell 111,

577–588 (2002).

91. Мори, К. Трехстороннее управление развернутыми белками в эндоплазматическом ретикулуме

. Cell 101, 451–454 (2000).

92. Шен, Дж., Чен, X., Хендершот, Л. и Прайвс, Р. ER стресс

регуляция локализации ATF6 путем диссоциации связывания

BiP / GRP78 и демаскирования локализации по Гольджи

сигналов.Dev. Клетка. 3, 99–111 (2002).

В этой статье показана роль BiP в восприятии стресса ER

путем регулирования стресс-индуцированного экспорта ER

фактора транскрипции ATF6.

93. Паладе, Г. Внутриклеточные аспекты процесса синтеза белка

. Science 189, 347–358 (1975).

94. Лотти, Л. В., Торриси, М. Р., Эрра, М. К. и Бонатти, С.

Морфологический анализ переноса гликопротеина VSV ts-045 G

из эндоплазматического ретикулума в промежуточный отсек

в клетках Vero.Exp. Cell Res.

227, 323–331 (1996).

95. Barlowe, C. COPII-зависимый транспорт из эндоплазматического ретикулума

. Curr. Opin. Cell Biol. 14,

417–422 (2002).

96. Аридор, М., Вайсман, Дж., Банных, С., Нуоффер, С. &

Балч, У. J. Cell. Биол. 141,

61–70 (1998).

97. Куен, М. Дж., Херрманн, Дж. М. и Шекман, Р.Взаимодействия груза COPII-

направляют сортировку белка в производные ER

транспортных пузырьков. Nature 391, 187–190 (1998).

98. Пфеффер, С. Р. и Ротман, Дж. Э. Биосинтетический белок

транспорт и сортировка эндоплазматическим ретикулумом

и Гольджи. Анну. Rev. Biochem. 56,

829–852 (1987).

99. Kuehn, M. J. & Schekman, R. COPII и захват секреторного груза

в транспортные пузырьки. Curr. Opin. Cell Biol.9,

477–483 (1997).

100. Гибсон Р., Шлезингер С. и Корнфельд С. Нгликозилированный гликопротеин

вируса везикулярного стоматита

чувствителен к температуре и подвергается внутриклеточной агрегации

при повышенных температурах. J. Biol. Chem. 254,

3600–3607 (1979).

101. Молинари, М., Галли, С., Пиккалуга, В., Пиерен, М.,

Паганетти, П. Последовательная помощь молекулярных шаперонов

и временное образование ковалентных комплексов

во время деградации белка из ER.

J. Cell Biol. 158. С. 247–257 (2002).

102. Ривера, В. М. и др. Регуляция секреции белка посредством контролируемой агрегации

в эндоплазматическом ретикулуме.

Наука 287, 826–830 (2000).

103. Mackenzie, J. M. & Westaway, E. G. Сборка и созревание

флавивируса вируса Кунджин, по-видимому, происходит в

грубом эндоплазматическом ретикулуме и вдоль секреторного пути

, соответственно. J. Virol. 75, 10787–10799 (2001).

104. Миронов А.А. и др. Белки-грузы и большие агрегаты

могут проходить через Гольджи по общему механизму

, не покидая просвет цистерн. J. Cell

Biol. 155, 1225–1238 (2001).

105. Lorenz, I.C. et al. Внутриклеточная сборка и секреция

рекомбинантных субвирусных частиц

из вируса клещевого энцефалита

. J. Virol. (В прессе).

106. Nehls, S. et al. Динамика и удержание неправильно свернутых

белков в нативных мембранах ER.Nature Cell Biol. 2,

288–295 (2000).

107. Левин М. Х., Хагги П. М., Ветривел Л. и Веркман А. С.

Диффузия в эндоплазматическом ретикулуме мутанта аквапорина-2

, вызывающего несахарный нефрогенный диабет человека.

J. Biol. Chem. 276, 21331–21336 (2001).

108. Спилиотис, Э. Т., Пентчева, Т. и Эдидин, М. Зондирование

мембранных доменов в эндоплазматическом ретикулуме:

удержание и деградация несобранных молекул MHC класса I

. Мол. Биол. Cell 13, 1566–1581 (2002).

109. Бут, К. и Кох, Г. Л. Нарушение клеточного кальция

индуцирует секрецию люминальных белков ER. Cell 59,

729–737 (1989).

110. Sambrook, J. F. Участие кальция в транспорте

секреторных белков из эндоплазматического ретикулума. Cell

61, 197–199 (1990).

111. Тату У. и Хелениус А. Взаимодействие вновь синтезированного аполипопротеина В

с калнексином и кальретикулином требует очистки

глюкозы в эндоплазматическом ретикулуме.Biosci.

Rep. 19, 189–196 (1999).

112. Менье, Л., Ушервуд, Ю. К., Чанг, К. Т. и

Хендершот, Л. М. Подмножество шаперонов и ферментов сворачивания

образуют мультипротеиновые комплексы в эндоплазматическом ретикулуме

для связывания растущих белков. Мол. Биол. Cell 13,

4456–4469 (2002).

113. Haggie, PM, Stanton, BA & Verkman, AS Diffusional

подвижность трансмембранного муковисцидоза

мутант регулятора проводимости, ∆F508-CFTR, в эндоплазматическом ретикулуме

, измеренный с помощью фотообесцвечивания

CF0002 G0003-CF0003 химеры.J. Biol. Chem. 277, 16419–16425

(2002).

114. Yamamoto, K. et al. Рецептор KDEL опосредует механизм извлечения

, который способствует контролю качества в эндоплазматическом ретикулуме

. EMBO J. 20, 3082–3091

(2001).

115. Хаммонд К. и Хелениус А. Контроль качества секреторного пути

: удержание неправильно свернутого вирусного гликопротеина

мембраны включает циклическое переключение между ER, промежуточным отсеком

и аппаратом Гольджи.J. Cell

Biol. 126, 41–52 (1994).

116. Miesenböck, G. & Rothman, J. E. Способность извлекать

ускользнувших белков ER распространяется на транс-большинство цистерн

стека Гольджи. J. Cell Biol. 129, 309–319

(1995).

117. Колдуэлл, С. Р., Хилл, К. Дж. И Купер, А. А. Деградация

субстратов для контроля качества эндоплазматического ретикулума (ER)

требует транспортировки между ER и Golgi. J. Biol.

Chem.276, 23296–23303 (2001).

118. Vashist, S. et al. Для контроля качества сворачивания белков эндоплазматического ретикулума

требуются механизмы четкого извлечения и удержания

. J. Cell Biol. 155,

355–368 (2001).

119. Таксис, К., Фогель, Ф. и Вольф, Д. Х. Трафик ER – Golgi является предпосылкой

для эффективной деградации ER. Мол. Биол. Cell

13, 1806–1818 (2002).

120. Зубер, К., Спиро, М. Дж., Гул, Б., Спиро, Р.G. & Roth, J.

Иммунолокализация эндоманнозидазы аппаратом Гольджи

предполагает сокращение уровня глюкозы в постэндоплазматическом ретикулуме:

последствия для контроля качества. Мол. Биол. Cell 11,

4227–4240 (2000).

121. Zuber, C. et al. Иммунолокализация UDP-

глюкоза: гликопротеин глюкозилтрансфераза указывает на участие

промежуточных продуктов пре-Гольджи в контроле качества белка

. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10710–10715

(2001).

122. Хонг, Э., Дэвидсон, А. Р. и Кайзер, С. А. Путь для

, нацеленный на растворимые неправильно свернутые белки в дрожжевую вакуоль.

J. Cell Biol. 135, 623–633 (1996).

123. Йоргенсен, М. У., Эмр, С. Д. и Винтер, Дж. Р. Распознавание лиганда

и доменная структура Vps10p, вакуолярного рецептора сортировки белков

в Saccharomyces cerevisiae.

Eur. J. Biochem. 260, 461–469 (1999).

124. Реджиори Ф. и Пелхэм Х.R. Трансмембранная убиквитин

лигаза, необходимая для сортировки мембранных белков в мультивезикулярные тельца

. Nature Cell Biol. 4. С. 117–123 (2002).

Вход в Windows по сравнению с входом в систему EasyMatch QC

Щелкните здесь, чтобы загрузить:
• Примечания по применению: вход в Windows по сравнению с входом в EasyMatch QC

Использование Windows 2000 и Windows XP стало обычным явлением в наши дни, и, по сути, HunterLab Программное обеспечение EasyMatch QC работает исключительно на платформах Windows 2000 и XP, оставляя Windows 95 и 98 в прошлом.Windows 2000 и XP обеспечивают повышенную безопасность и гибкость по сравнению с более ранними версиями Windows, но они также могут сделать установку и использование вашего Программное обеспечение HunterLab немного сложнее. Обширные административные инструменты и пользовательские параметры привилегий, встроенные в Windows, теперь необходимо учитывать при настройке вашего компьютера для запустите EasyMatch QC.

Что мне нужно знать перед установкой программного обеспечения?
Примечание. Если вы будете устанавливать EasyMatch QC-ER, предварительная установка EasyMatch QC-ER Мастер доступен с версиями 3.70 и выше определят все, что вам нужно знать перед установка программного обеспечения. Обратитесь к записной книжке по валидации и соответствию для получения инструкций по с помощью этого мастера.

1. Версия Windows, которую вы используете. Это проще всего определить, открыв Проводник Windows или «Мой компьютер» и выберите «О Windows» в меню «Справка». На появившемся экране вы точно узнаете, какая версия Windows установлена. Если вы используете Windows XP, 2000 или NT 4.0 или выше, элементы в остальной части этого Примечание по приложениям вас заинтересует.

2. Если учетные записи пользователей и логин используются в Windows. Вы будете знать, что учетные записи пользователей используются для этой установки Windows, если вы видите экран, похожий на следующий где вам необходимо ввести имя пользователя и пароль, прежде чем вы сможете использовать компьютер. Если вы никогда не видите этот экран, скорее всего, учетные записи пользователей не используются. Если вы не уверены, спросите своего руководителя или системного администратора.Если вам или кому-то другому необходимо войти в Windows перед использованием компьютера, элементы в остальной части этого примечания по приложениям будут беспокоит вас.

3. Какую учетную запись пользователя вы будете использовать для установки программного обеспечения. Учетная запись Windows в группе «Администраторы» требуется для установки EasyMatch QC. Вы можете определить является ли ваша учетная запись частью этой группы, нажав Пуск, Настройки (в Windows 2000 только), затем Панель управления. Если вы используете Windows XP, нажмите «Перейти к классическому виду». в верхнем левом углу появившегося экрана.Если отображается «Перейти к просмотру категорий», НЕ нажимайте. В правой части экрана дважды щелкните Учетные записи пользователей (Пользователи и Пароли в Windows 2000). Все учетные записи пользователей, настроенные для этого компьютера, будут показано.

Щелкните здесь, чтобы загрузить:
• Примечания по применению: вход в Windows по сравнению с входом в EasyMatch QC

Контроль качества мембранного белка — Биохимия клеточного белка

  1. Home
  2. Research
  3. Мембранный белок QC

Для поддержания гомеостаза и взаимодействия с окружающей средой клетки зависят от интегральных мембранных белков, которые могут охватывать плазматическую мембрану или различные мембраны, которые включают различные органеллы эукариотической клетки.Соответственно, примерно треть протеома человека состоит из мембранных белков. Большинство из них продуцируются в эндоплазматическом ретикулуме (ER), где они ко-трансляционно интегрируются в мембрану через транслокон .
В отличие от полярной водной среды, где глобулярные белки приобретают свою структуру и выполняют свои функции, основные части мембранных белков интегрированы в гидрофобную внутреннюю часть липидного бислоя. Однако полярные остатки очень часто встречаются в трансмембранных сегментах, выполняя важные функциональные и структурные роли, но потенциально нарушая интеграцию мембран.Кроме того, различные заболевания человека вызываются генетическими мутациями, которые вводят полярные остатки в трансмембранные сегменты, часто приводящие к нарушению транспорта из ER.
Наша работа направлена ​​на анализ клеточных механизмов и механизмов, которые контролируют правильную интеграцию и сборку мембранных белков, а также обнаруживают и обрабатывают аберрантную мембранную интеграцию в клетке.

Полярные остатки в сегментах TM. Структурные требования, функциональные требования, например в ионных каналах или генетические мутации могут быть причиной полярных остатков в сегментах TM.

QC Сделано: Свинец (ч) эр | QC Make It Here

«Я думаю, это действительно здорово, что здесь я могу обратиться к людям с любой стороны спектра — финансовой, политической, властной — с идеей, и все они будут восприимчивы к ней.Это может быть не слишком достижимо в таком большом городе, как Чикаго ».

Мелисса Пеппер — основательница Lead (h) er, некоммерческой организации, которая связывает женщин с местными опытными лидерами, чтобы способствовать их карьере и участию в жизни общества. Фирменная программа Lead (h) er — это программа Strike a Match, которая дает вам индивидуально подобранного наставника, основанного на том, чего вы хотите достичь — будь то карьерный рост, связь с сообществом или даже желание творить. что-то необычное, например, благотворительная организация для 3-5-летних игроков в софтбол, живущих в Небраске.Чего бы вы ни хотели достичь, ведущий постарается найти наставника, который поможет вам в этом.

Мелисса решила начать эту программу менее двух лет назад в Quad Cities, набирая ее у Сары Стивенс, главного исполнительного директора, сразу после запуска. Оба хотели найти что-то значимое и значимое для местного сообщества.

«Пять или шесть моих друзей уехали в одно лето из-за работы. Я чувствовал, что, если у людей нет корней и поддержки в сообществе, они не будут чувствовать себя обязанными оставаться.Лидер (человек) — это объединение женщин в сообществе, чтобы у них была система поддержки, которая могла бы помочь с работой, участием или всем, что им нужно ».

Когда спросили, зачем начинать лидера в Quad Cities, а не где-то в Чикаго, они оба объяснили разницу во времени: «Quad Cities — прекрасное место для достижения тех целей, которые у вас есть, потому что [сообщество] достаточно мала, чтобы люди могли расширять свои сети способами, которые не кажутся непреодолимыми. — Трудно расширить свою сеть в Чикаго, — сказала Мелисса.

«Здесь вам потребуется два шага, чтобы добраться до человека, с которым вы хотите поговорить о своей идее. В Чикаго вам понадобится семь, — соглашается Сара.

Мелисса подчеркнула, что готовность людей помочь и дать обратную связь — еще одна причина, по которой Лид (ч) преуспел здесь: «Я думаю, это действительно здорово, что здесь я могу обратиться к людям любой из сторон 7 спектра — финансовой, политической, властной — с идеей, и пусть все будут восприимчивы к ней. Это может быть не слишком достижимо в таком большом городе, как Чикаго.”

Сара — уроженка Квад-Сити и вернулась после колледжа, чтобы остепениться. Мелисса училась в Августане после школы и решила пустить корни после ее окончания. Оба они согласились с тем, что есть множество причин, по которым они решили остаться в Quad Cities, например, стоимость жизни и размер района, но для них именно годы становления здесь — это то, что заставило их вернуться и остаться. Сара сказала, что специально вернулась сюда, чтобы вырастить своих детей. «Я верил, что у моих детей будут более разносторонние отношения из-за размера сообщества.Здесь легче наладить эти отношения, и я надеюсь, что то, что они узнают здесь о силе связи, поможет им в будущем и поможет им узнать, где поселиться ».

Мелисса объясняет, почему именно Quad Cities было местом для нее, благодаря своему опыту в Августане и сообществу. «Оги действительно хорош в том, чтобы заставить вас учиться и думать о ваших отношениях с сообществом, и он был чрезвычайно полезен, сделав меня« деятелем ». У меня есть возможность присутствовать на этих встречах с руководителями, и мое мнение выслушивают и понимают , а не просто уволен, потому что я слишком молод или неопытен.Через Оги и через это сообщество мне была предоставлена ​​возможность сказать что-то и сделать то, что я делаю сейчас, — с отзывчивой и обнадеживающей обратной связью. Вот почему мне показалось, что это подходящее место ».

The Quad Cities — это оживленное и яркое место, и Make it Here хочет, чтобы молодые люди, которые приходят в это сообщество, видели, что это отличное место для построения карьеры и поддержки сообщества с помощью таких программ, как Lead ( ее.

Сара прекрасно резюмирует это: «Здесь гораздо больше возможностей взять то, о чем вы мечтаете, и воплотить его в жизнь.Как молодой человек, который только начинает свою жизнь, вы можете заметить, что есть вещи, которые действительно волнуют в переезде, начале карьеры или бизнесе. При всем этом может быть страшно. Вы можете много рисковать и можете потерпеть неудачу, но самое замечательное в Quad Cities — это то, что вы можете создать те связи и то сообщество, которое будет рядом, чтобы поймать вас, если вы упадете »


Вы можете проверить организацию Мелиссы Пеппер и Сары Стивенс по адресу www.leadherqc.org или на Facebook по адресу www.facebook.com/leadherqc.

Зависимый от сигнального мотива ER экспорт Qc-SNARE BET12 взаимодействует с MEMB12 и влияет на трафик PR1 у Arabidopsis | Журнал клеточной науки

Компартментализация клеток у эукариот предполагает развитие механизмов переноса белков между различными органеллами, заключенными в мембрану. Везикулярный транспорт является преобладающим путем транспортировки белков в эукариотических клетках.Множественные молекулярные механизмы необходимы для образования, транспорта, связывания и слияния пузырьков с целевым компартментом (Bonifacino and Glick, 2004). Растворимые рецепторы белков прикрепления слитых белков, чувствительных к N-этилмалеимиду (SNARE), были идентифицированы как критические компоненты, участвующие в финальной стадии слияния для путей везикулярного транспорта (Söllner et al., 1993). Они облегчают слияние везикулы-мишени-мембраны за счет образования гетеротетрамерных комплексов trans -SNARE, происходящих из определенного набора белков SNARE (Jahn and Scheller, 2006; McNew et al., 2000).

Большое количество белков SNARE кодируется в геноме растений (Sanderfoot, 2007; Sanderfoot et al., 2000). Многочисленные исследования раскрыли важную роль белков SNARE в растениях, включая различные биологические процессы, включая защиту от патогенов, цитокинез, абиотический стресс, размножение клеток, симбиоз, гравитропизм, гаметофиты и развитие семян (Ebine et al., 2008; El-Kasmi et al. ., 2011; Грефен и др., 2010a; Hachez et al., 2014; Honsbein et al., 2009; Huisman et al., 2016; Pan et al., 2016; Reichardt et al., 2007; Uemura et al., 2012b; Яно и др., 2003). Точное нацеливание белков SNARE на отдельный компартмент является важным для обеспечения слияния пузырьков с мишенью и мембраной, что обеспечивает эффективный и точный перенос белков. Неправильное нацеливание белков SNARE приводит к многочисленным клеточным дефектам. Например, формирование клеточной пластинки нарушено у мутанта с нарушенным переносом синтаксина KNOLLE (Park et al., 2013; Тех и др., 2013). Кроме того, недавнее исследование показало новую роль SNARE SYP73, ассоциированного с эндоплазматическим ретикулумом (ER), в поддержании целостности ER и, следовательно, потоковой передачи, поскольку эти особенности были изменены у мутанта syp73 (Cao et al., 2016) . Следовательно, правильная локализация белков SNARE, по-видимому, является предпосылкой для их правильного функционирования в различных клеточных процессах.

Большинство белков SNARE являются заякоренными в хвосте (TA) белками, их мембранная ассоциация обеспечивается С-концевым трансмембранным доменом (TMD).Белки ТА посттрансляционно встраиваются в мембрану посредством управляемого входа белков ТА (GET) (Schuldiner et al., 2008; Stefanovic and Hegde, 2007). Недавние исследования продемонстрировали функциональные компоненты GET для нацеливания на белок TA в Arabidopsis (Xing et al., 2017) для процесса, посредством которого SNARE SYP72 вставляется в мембрану ER через путь GET (Srivistava et al., 2016). После транслокации в ER дальнейшее нацеливание мембранных белков определяется либо конкретными сигнальными мотивами, длиной TMD, либо их комбинацией (Brandizzi et al., 2002; Hanton et al., 2006, 2005b; Матесон и др., 2006; Рохо и Денеке, 2008; Saint-Jore-Dupas et al., 2006). На раннем секреторном пути растений белки, которые экспортируются из ER и передаются в Golgi, опосредуются механизмом комплекса белков оболочки II (COPII) (Brandizzi and Barlowe, 2013; DaSilva et al., 2004; Hawes et al., 2008; Моро и др., 2007; Робинсон и др., 2015; Стефано и др., 2014). Согласно модели у дрожжей и млекопитающих, образование везикул COPII инициируется рекрутированием небольшой GTPase SAR1 на мембрану ER.Активированный SAR1 затем рекрутирует димерный комплекс внутренней оболочки SEC23-SEC24, который захватывает белковые грузы. Последующее рекрутирование комплекса внешней оболочки SEC13-SEC31 стимулирует GTP-гидролиз активированного SAR1 и в конечном итоге приводит к образованию переносчиков COPII, содержащих белковые грузы для экспорта (Bassham et al., 2008; Chung et al., 2016; Hwang и Робинсон, 2009; Марти и др., 2010). Сообщается, что среди белков SNARE, локализованных по Гольджи (Uemura et al., 2004), SYP31 и MEMB11 играют решающую роль в обеспечении антероградного транспорта ER-to-Golgi (Bubeck et al., 2008; Chatre et al., 2005). Хотя роль белков SNARE в раннем секреторном пути была исследована, механизм нацеливания SNARE на мембрану Гольджи остается неясным. До сих пор только одно исследование продемонстрировало, что экспорт ER и нацеливание SYP31 по Гольджи зависит от двухкислотного мотива на его N-конце (Chatre et al., 2009).

В настоящем исследовании мы стремились выяснить механизм нацеливания и функциональную роль Qc-SNARE BET12 (также называемого Bs14b) в раннем секреторном пути.Предыдущие исследования показали, что BET12 участвует в фертильности растений и обнаруживает локализацию Гольджи в протопластах Arabidopsis (Bolanos-Villegas et al., 2015). BET11 (также называемый Bs14a) имеет 78% аминокислотное сходство с BET12 и, как предполагается, также локализуется на мембранах Гольджи (Uemura et al., 2004). В отличие от SYP31 и MEMB11, сверхэкспрессия BET11 не оказывает серьезного влияния на антероградный транспорт белка ER-to-Golgi (Bubeck et al., 2008; Chatre et al., 2005). Поразительно, что исследование in vitro на дрожжах показало, что BET11 и BET12 имеют тенденцию образовывать отдельный четвертичный комплекс SNARE с разными SNARE Гольджи дрожжей, поскольку BET11 имеет профиль связывания SNARE, который напоминает профиль связывания Sft1p, тогда как профиль связывания BET12 напоминал Bet1p (Tai and Banfield, 2001).Чтобы охарактеризовать роль BET12 в транспортировке ER-to-Golgi белков, мы сначала определили субклеточную локализацию BET12 в трансгенных растениях и раскрыли механизм нацеливания, зависимый от сигнального мотива, который был необходим для эффективного экспорта ER. Мы также идентифицировали Qb-SNARE MEMB12 как взаимодействующего партнера BET12 и провели эксперименты, которые предположили, что они выполняют функцию регуляции секреции связанного с патогенезом белка 1 (PR1; At2g14610) в Arabidopsis .

Чтобы определить субклеточную локализацию BET12, мы создали трансгенные растения, экспрессирующие на N-конце желтый флуоресцентный белок (YFP), помеченный BET12 (YFP – BET12), управляемый промотором UBQ10 . Анализ с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) выявил точечный характер распределения YFP-BET12 в клетках корня Arabidopsis . Иммунофлуоресцентное мечение с использованием антител против органеллоспецифических маркеров было выполнено и выявило, что YFP-BET12 частично колокализовался с маркером Гольджи EMP12 (также известным как TMN1) и маркером trans -сети Гольджи (TGN) SYP61, но отличался от маркера SYP61. Маркер ЭР кальретикулин (рис.1A – C), подтверждая, что YFP – BET12 локализуется как в Golgi, так и в TGN.

Рис. 1.

YFP – BET12 локализуется в сети Гольджи и транс -Гольджи в трансгенных растениях Arabidopsis . (A – C) Конфокальная иммунофлуоресцентная маркировка, показывающая, что YFP-BET12 частично колокализуется с маркером Гольджи (A) EMP12 и маркером TGN (B) SYP61, но отличается от маркера ER (C) кальретикулина в трансгенных клетках корня арабидопсиса .Вставка представляет собой двукратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Линейный коэффициент корреляции Пирсона (r p ) и диаграмма рассеяния (правая панели) были получены с использованием ImageJ с подключаемым модулем колокализации PSC путем анализа 20 отдельных конфокальных изображений для каждого исследования. Значение r p +1,0 представляет полную локализацию. Масштабные линейки: 10 мкм. (D) Конфокальные изображения, показывающие совместную локализацию BFA-индуцированной агрегации YFP-BET12 и эндоцитарного индикатора FM4-64.5-дневные трансгенные проростки обрабатывали 10 мкг / мл BFA в течение 30 минут с последующим поглощением FM4-64 в течение еще 30 минут перед визуализацией. Вставка представляет собой двукратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Увеличение показывает, что агрегаты YFP-BET12 образуются на периферии, а также в центральном компартменте BFA, помеченном FM4-64. Конфокальные изображения были получены от 10 отдельных проростков. Масштабная линейка: 10 мкм. (E) Линейный график, созданный ImageJ, показывающий интенсивность флуоресценции YFP-BET12 (зеленый) и FM4-64 (красный) вдоль агрегатов, индуцированных BFA (линия, отмеченная a и b), показанных на D.(F) Мечение с помощью электронной микроскопии Immunogold, показывающее присутствие YFP-BET12 в Golgi и TGN. Частицы золота присутствовали как на Гольджи (сплошные стрелки), так и на TGN (светлые стрелки). Масштабные линейки: 100 нм. (G) Относительный процент (среднее ± стандартное отклонение) распределения золотых частиц, обнаруженных в Гольджи, TGN и органеллах, отличных от Гольджи и TGN. Для количественной оценки использовали 20 электронных микрофотографий, показывающих маркировку анти-GFP.

Рис. 1.

YFP – BET12 локализуется в сети Гольджи и транс -сети Гольджи в трансгенных растениях Arabidopsis . (A – C) Конфокальная иммунофлуоресцентная маркировка, показывающая, что YFP-BET12 частично колокализуется с маркером Гольджи (A) EMP12 и маркером TGN (B) SYP61, но отличается от маркера ER (C) кальретикулина в трансгенных клетках корня арабидопсиса . Вставка представляет собой двукратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Линейный коэффициент корреляции Пирсона (r p ) и диаграмма рассеяния (правая панели) были получены с использованием ImageJ с подключаемым модулем колокализации PSC путем анализа 20 отдельных конфокальных изображений для каждого исследования.Значение r p +1,0 представляет полную локализацию. Масштабные линейки: 10 мкм. (D) Конфокальные изображения, показывающие совместную локализацию BFA-индуцированной агрегации YFP-BET12 и эндоцитарного индикатора FM4-64. 5-дневные трансгенные проростки обрабатывали 10 мкг / мл BFA в течение 30 минут с последующим поглощением FM4-64 в течение еще 30 минут перед визуализацией. Вставка представляет собой двукратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Увеличение показывает, что агрегаты YFP-BET12 образуются на периферии, а также в центральном компартменте BFA, помеченном FM4-64.Конфокальные изображения были получены от 10 отдельных проростков. Масштабная линейка: 10 мкм. (E) Линейный график, созданный ImageJ, показывающий интенсивность флуоресценции YFP-BET12 (зеленый) и FM4-64 (красный) вдоль BFA-индуцированных агрегатов (линия, отмеченная a и b), показанных на D. (F) Электронная микроскопия Immunogold маркировка, показывающая присутствие YFP ​​– BET12 в Golgi и TGN. Частицы золота присутствовали как на Гольджи (сплошные стрелки), так и на TGN (светлые стрелки). Масштабные линейки: 100 нм. (G) Относительный процент (среднее ± стандартное отклонение) распределения золотых частиц, обнаруженных в Гольджи, TGN и органеллах, отличных от Гольджи и TGN.Для количественной оценки использовали 20 электронных микрофотографий, показывающих маркировку анти-GFP.

В предыдущих исследованиях сообщалось, что грибковый токсин Брефельдин A (BFA) вызывает агрегацию как Golgi, так и TGN, причем агрегаты, полученные из Golgi и TGN, отличаются друг от друга (Lam et al., 2009; Zhang et al., 2011а). Чтобы еще раз доказать локализацию YFP-BET12, мы провели обработку BFA с последующим экспериментом по поглощению стирилового красителя FM4-64, поскольку краситель можно использовать в качестве эндоцитарного индикатора для мечения эндосомных компартментов, включая TGN (Bolte et al., 2004), используя трансгенные растения, экспрессирующие ST-YFP ( trans -маркер Гольджи; ST — сиалилтрансфераза крысы ST6GAL1), VHAa1-GFP (маркер TGN) и YFP-BET12. После обработки BFA, VHAa1-GFP был обнаружен в агрегатах с плотным ядром, называемых тельцами BFA, вместе с FM4-64, в то время как ST-YFP отчетливо обнаруживался на периферии помеченного FM4-64 тельца BFA (рис. S1A, B). ). Строили линейные графики, чтобы показать соответствующую интенсивность флуоресценции вдоль агрегатов, индуцированных BFA. Из них видно, что пик VHAa1-GFP полностью перекрывается с пиком FM4-64, тогда как пик ST-YFP в значительной степени отделен от пика FM4-64 (рис.S1A, B). Сходным образом картина флуоресценции YFP-BET12 изменялась от точечной до агрегированной после обработки BFA (Fig. 1D). Однако, в отличие от ST-YFP и VHAa1-GFP, агрегат YFP-BET12 обнаруживается не только в агрегате FM4-64 с плотным ядром, но также на его периферии (Fig. 1D). Графики линий интенсивности флуоресценции вдоль агрегата YFP-BET12 показали картину распределения, отличную от ST-YFP и VHAa1-GFP, в том, что интенсивность сигнала YFP-BET12 оставалась высокой как на периферии, так и в центральной области пика FM4-64 (рис.1E), указывая на то, что YFP-BET12 захватывается как агрегатами, производными от Гольджи, так и агрегатами, производными от TGN.

Для дальнейшего подтверждения локализации YFP – BET12 на основе анализа CLSM мы выполнили иммунологическую электронную микроскопию (ЭМ) с антителами против GFP (распознающими YFP) на ультратонких срезах, приготовленных из замороженных под высоким давлением и замороженных клеток корня трансгенных Проростки Arabidopsis , экспрессирующие YFP-BET12.В соответствии с нашими конфокальными данными, наблюдения с помощью ЭМ показали, что частицы золота (на вторичных антителах, распознающих анти-GFP) присутствовали как на стеках Гольджи, так и на ассоциированном TGN (рис. 1F). Количественная оценка мечения иммуноголотом показала, что ~ 37% и ~ 52% частиц золота были связаны с Гольджи (включая обе стороны цис, — и транс ) и TGN, соответственно (рис. 1G). Взятые вместе, исследования CLSM и EM продемонстрировали, что YFP-BET12 локализован как в Golgi, так и в TGN в трансгенных растениях Arabidopsis .

Чтобы выяснить механизм нацеливания на BET12, нам сначала нужно было знать топологию его белка. Большинство белков SNARE являются мембранными белками типа II, с N-концом, содержащим мотив SNARE, доступным цитозолю, и с C-концом TMD. Чтобы определить, является ли BET12 мембранным белком, общие белки экстрагировали из клеток Arabidopsis , экспрессирующих YFP-BET12, а затем разделяли на растворимую и мембранную фракции ультрацентрифугированием.Иммуноблот-анализ с использованием антител против GFP показал, что YFP-BET12 был обнаружен в мембранной фракции, но не в растворимой фракции (рис. S2A, дорожки 1 и 2). Чтобы отличить интегральный белок от периферического мембранного белка, выделенные микросомы затем подвергали промывке с высоким содержанием соли, высоким pH и детергентом с последующим иммуноблоттингом с антителами против GFP. Надежность анализа была подтверждена с помощью антитела против VSR (это антитело распознает несколько белков VSR), поскольку известно, что VSR является интегральным мембранным белком (Paris et al., 1997). Иммуноблот-анализ показал, что YFP-BET12 оставался связанным с микросомальной мембраной в условиях высокого содержания соли и высокого pH, но выделялся в растворимую фракцию при промывании детергентом (рис. S2A, дорожки 3–10). Реакция YFP-BET12 на разные условия была сходной с таковой для VSR, указывая тем самым, что BET12, скорее всего, является интегральным мембранным белком.

Как определено анализом последовательности (сервер TMHMM 2.0), прогнозируется, что BET12 будет иметь типичную топологию SNARE (рис. S2B). Чтобы определить, сохраняет ли слияние YFP-BET12 ту же топологию, мы провели анализ защиты протеазы с использованием микросом, выделенных из клеток Arabidopsis , экспрессирующих YFP-BET12, с последующим иммуноблоттингом с антителами против GFP. GFP – VSR2, мембранный белок с известной топологией, в которой N-конец обращен в просвет (Cai et al., 2011), был использован в качестве контроля в этом анализе. Полоса не была обнаружена при иммуноблот-анализе YFP-BET12 в присутствии протеазы трипсина, что указывает на то, что N-конец вместе с YFP обращен к цитозолю и, следовательно, может быть переварен трипсином (рис.S2C, дорожка 2). Напротив, полоса была обнаружена в иммуноблоте GFP-VSR2, показывая, что его обращенный к просвету N-конец был защищен от переваривания трипсином (рис. S2C, дорожка 5). Как и ожидалось, полосу для YFP-BET12 и GFP-VSR2 нельзя было обнаружить в присутствии как трипсина, так и Triton X-100 (рис. S2C, дорожки 3 и 6). Результаты этих биохимических анализов предполагают, что YFP-BET12 является интегральным мембранным белком, который поддерживает типичную топологию SNARE с его N-концом, обращенным к цитозолю.

Используя определенную топологию белка BET12, мы затем сгенерировали различные варианты усечения и делеции YFP-BET12 с последующей временной экспрессией в протопластах Arabidopsis для идентификации областей, которые ответственны за транспортировку BET12.После временной экспрессии YFP-BET12 и анализа CLSM с помощью органелл-специфичных маркеров можно было видеть, что YFP-BET12 частично колокализуется с маркером Гольджи Man1-RFP и маркером TGN mRFP-SYP61 (Fig. 2A, B). Поскольку YFP-BET12 обнаруживает частичную локализацию по Гольджи и TGN как в временно экспрессирующих протопластах, так и в трансгенных растениях, мы решили использовать временные установки для скрининга на предмет дефектов, вызванных усечением и делецией YFP-BET12. Сначала мы удалили весь цитозольный N-конец BET12, чтобы определить его влияние на трафик.Анализ CLSM показал, что YFP-BET12 (107-130) совместно локализован с маркером ER CNX-RFP и демонстрирует паттерн ER (рис. 2C), указывая на то, что присутствия TMD и C-конца недостаточно для его экспорта в ER, и цитозольный N-конец, вероятно, содержит сигналы экспорта ER. Поскольку в предыдущих исследованиях предполагалось, что мотив SNARE играет роль в нацеливании на SNARE (Joglekar et al., 2003), мы также удалили мотив BET12 SNARE, чтобы проверить какой-либо дефект нацеливания. При временной экспрессии YFP-BET12 (1-32) (98-130) демонстрировал точечный рисунок, который совместно локализовался с Man1-RFP (рис.2D), предполагая, что мотив SNARE не важен для экспорта BET12 ER. Чтобы идентифицировать область, содержащую сигналы экспорта ER, мы дополнительно удалили девять аминокислот (а.о.) между мотивом SNARE и TMD. Интересно, что вместо того, чтобы показывать только точечный паттерн, YFP-BET12 (1-32) (107-130) частично колокализовался с CNX-RFP и также отображал паттерн ER (рис. 2E). Этот результат предполагает, что сам N-конец (а.о. 1–32) содержит сигнал экспорта ER и помогает в нацеливании на Гольджи, что приводит к паттерну точечных точек (рис.2F). Делеция девяти аминокислот (98-106 а.о.) в некоторой степени ингибирует экспорт ER, тем самым приводя к появлению паттерна ER. Точно так же присутствие как пунктированного, так и ER-паттерна также наблюдалось при экспрессии YFP-BET12 (98-130) (рис. 2G, H), что подтверждает мнение о том, что девять аминокислот (aa 98-106) также содержат ER экспортный сигнал и помощь в нацеливании BET12, в то время как отсутствие самого N-конца (aa 1–32) затрудняет его экспортную эффективность ER. Взятые вместе, in vivo экспрессия усеченных и удаленных версий YFP-BET12 выявила, что оба N-конца (a.а. 1–32) и область между мотивом SNARE и TMD (a.a. 98–106) BET12 содержат сигналы экспорта ER и ответственны за его эффективную транспортировку.

Рис. 2.

Эффективный экспорт BET12 из ER зависит как от его N-концевой области, так и от области между мотивом SNARE и TMD. (A, B) Конфокальные изображения, показывающие частичную совместную локализацию YFP-BET12 с маркером Гольджи (A) Man1-RFP и маркером TGN (B) mRFP-SYP61 в протопластах Arabidopsis .Правая панель — это увеличенный в 3 раза прямоугольник, обведенный пунктирной линией. Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ) со значением r p +1,0 для полной колокализации. Масштабная линейка: 10 мкм. (C – H) Конфокальные изображения, показывающие различные субклеточные локализации различных укороченных и делеционных слияний YFP-BET12 (схематически показаны вверху рисунка) при совместной экспрессии с маркером ER CNX-RFP и маркером Гольджи Man1-RFP.Сеть (C) ER, (D) точка Гольджи и (E – H) комбинация структуры ER и точки Гольджи соответствующих слияний усечения и делеции наблюдалась в протопластах Arabidopsis . Правая панель — это увеличенный в 3 раза прямоугольник, обведенный пунктирной линией. Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ), где значение r p , равное +1,0, представляет полную колокализацию. Масштабные линейки: 10 мкм.

Фиг.2.

Эффективный экспорт BET12 из ER зависит как от его N-концевой области, так и от области между мотивом SNARE и TMD. (A, B) Конфокальные изображения, показывающие частичную совместную локализацию YFP-BET12 с маркером Гольджи (A) Man1-RFP и маркером TGN (B) mRFP-SYP61 в протопластах Arabidopsis . Правая панель — это увеличенный в 3 раза прямоугольник, обведенный пунктирной линией. Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ) со значением r p , равным +1.0 для полной колокализации. Масштабная линейка: 10 мкм. (C – H) Конфокальные изображения, показывающие различные субклеточные локализации различных укороченных и делеционных слияний YFP-BET12 (схематически показаны вверху рисунка) при совместной экспрессии с маркером ER CNX-RFP и маркером Гольджи Man1-RFP. Сеть (C) ER, (D) точка Гольджи и (E – H) комбинация структуры ER и точки Гольджи соответствующих слияний усечения и делеции наблюдалась в протопластах Arabidopsis . Правая панель — это увеличенный в 3 раза прямоугольник, обведенный пунктирной линией.Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ), где значение r p , равное +1,0, представляет полную колокализацию. Масштабные линейки: 10 мкм.

Чтобы выяснить механизм торговли BET12, мы использовали регион, идентифицированный как содержащий сигналы экспорта ER, чтобы выяснить потенциальных партнеров по взаимодействию и связанный механизм торговли.Синтетический пептид из девяти аминокислот (а.о. 98-106, содержащий мотив экспорта ER) конъюгировали на шарики сефарозы в качестве приманки для экспериментов с понижением. Гранулы сефарозы, конъюгированные с этим пептидом или без него, инкубировали с общими белками, экстрагированными из суспензионных клеток Arabidopsis . После промывки белки элюировали с гранул и подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром (фиг. 3A). В дублированных экспериментах интенсивные полосы, которые неоднократно наблюдались на дорожке с конъюгированным пептидом, но не с пустой сефарозой, выделяли для анализа тандемной масс-спектрометрии (МС / МС).Анализ МС / МС показал, что определенные белки, извлеченные пептидом из девяти аминокислот, были идентифицированы как компоненты механизмов COPI (ε-COP и ζ-COP) и COPII (Sar1) (Таблица S1). Сообщалось, что механизмы COPI и COPII важны для регуляции трафика белков ER-to-Golgi (Gao et al., 2014; Hanton et al., 2005a; Paul and Frigerio, 2007). Как локализованный по Гольджи SNARE, BET12, вероятно, взаимодействует с компонентами механизмов COPI и COPII, чтобы поддерживать свою правильную локализацию. Чтобы определить, действительно ли это так, мы временно экспрессировали YFP-BET12 вместе с GDP-фиксированной мутантной формой фактора ADP-рибозилирования 1 (Arf1-GDP), который мешает работе COPI (Pimpl et al., 2003; Takeuchi et al., 2002), а также с GTP-заблокированной версией мутанта SAR1 (SAR1-GTP), который вмешивается в механизм COPII и ингибирует экспорт белка из ER (Osterrieder et al., 2010; Takeuchi et al., 2000; Zeng et al., 2015). Анализ CLSM показал, что YFP-BET12 перемещается в ER и колокализуется с маркером ER CNX-RFP при коэкспрессии с Arf1-GDP (Fig. 3B). Точно так же YFP-BET12 демонстрирует паттерн ER при коэкспрессии с мутантной формой SAR1, заблокированной GTP, Sar1C-DN-RFP, что указывает на его неспособность подвергнуться экспорту ER при нарушении механизма COPII (рис.3С). Анализ методом Pulldown MS / MS вместе с данными, полученными в результате биологического исследования in vivo клеток , показал, что трафик BET12 зависит от функциональных механизмов COPI и COPII.

Рис. 3.

Компоненты механизмов COPI и COPII связываются с пептидом BET12 и влияют на нацеливание на BET12. (A) Синтетический пептид определенного участка (а.о. 98-106) BET12 конъюгировали с сефарозой и инкубировали с белками, экстрагированными из суспензионных клеток Arabidopsis .Элюированные белки подвергали окрашиванию серебром с последующим анализом МС / МС. Белки, идентифицированные как компоненты COPI и COPII, указаны стрелками. Полный список белков, идентифицированных с помощью анализа MS / MS, включен в дополнительную информацию (Таблица S1). M, маркер молекулярной массы. (B, C) Конфокальные изображения, показывающие влияние на трафик YFP-BET12, когда он коэкспрессируется с Arf1-GTP и Sar1C-DN-RFP (заблокированный GTP мутант SAR1). YFP-BET12 демонстрирует паттерн ER при коэкспрессии с (B) Arf1-GTP и (C) Sar1C-DN-RFP в протопластах Arabidopsis .Масштабная линейка = 10 мкм.

Рис. 3.

Компоненты механизмов COPI и COPII связываются с пептидом BET12 и влияют на нацеливание на BET12. (A) Синтетический пептид определенного участка (а.о. 98-106) BET12 конъюгировали с сефарозой и инкубировали с белками, экстрагированными из суспензионных клеток Arabidopsis . Элюированные белки подвергали окрашиванию серебром с последующим анализом МС / МС. Белки, идентифицированные как компоненты COPI и COPII, указаны стрелками. Полный список белков, идентифицированных с помощью анализа MS / MS, включен в дополнительную информацию (Таблица S1).M, маркер молекулярной массы. (B, C) Конфокальные изображения, показывающие влияние на трафик YFP-BET12, когда он коэкспрессируется с Arf1-GTP и Sar1C-DN-RFP (заблокированный GTP мутант SAR1). YFP-BET12 демонстрирует паттерн ER при коэкспрессии с (B) Arf1-GTP и (C) Sar1C-DN-RFP в протопластах Arabidopsis . Масштабная линейка = 10 мкм.

Тесная связь BET12 с оборудованием COPII побудила нас детально изучить N-конец (a.а. 1–32) и область между мотивом SNARE и TMD (а.о. 98–106) для более точной идентификации аминокислотных остатков, ответственных за COPII-опосредованный экспорт ER. Путем выравнивания последовательностей мы идентифицировали мотивы, которые связываются и взаимодействуют с Sar1 и Sec24, как сообщалось ранее. У дрожжей было показано, что комплекс внутренней оболочки COPII Sec23-Sec24 связывается с LxxLE и обеспечивает экспорт SNARE Bet1 ER (Mossessova et al., 2003). Интересно, что COPII-связывающий мотив LxxLE присутствует в N-концевой области (a.а. 1–32) BET12 (рис. 4A, синим цветом). Кроме того, двухосновный мотив гликозилтрансферазы, как было обнаружено, взаимодействует с Sar1 в клетках млекопитающих (Giraudo and Maccioni, 2003). Сходный двухосновный мотив был идентифицирован в области между мотивом BET12 SNARE и TMD (a.a. 98-106) (рис. 4A, синим цветом). Чтобы доказать консервативную роль этих мотивов в экспорте ER, мы создали две мутированные конструкции BET12 с точечными мутациями в двухосновных мотивах LxxLE и RK соответственно, которые обозначены как YFP-BET12 (L18A, L21A, E22A) и YFP-BET12 (R102A, К103А).Затем мы провели эксперимент по временной экспрессии с использованием протопластов Arabidopsis и определяли субклеточную локализацию этих мутированных белков BET12 с помощью CLSM. В отличие от единственного точечного рисунка, отображаемого YFP-BET12 (рис. 4B), как YFP-BET12 (L18A, L21A, E22A), так и YFP-BET12 (R102A, K103A) показали точечный рисунок и рисунок ER, который частично совмещался с CNX-RFP. (Рис. S3A, B), предполагая, что отдельные мутации в одном из потенциальных COPII-связывающих мотивов вызывают частичный дефект в экспорте BET12 ER.Для дальнейшей оценки роли этих мотивов мы создали конструкцию с пятью точечными мутациями, так что все пять остатков стали остатками аланина, названными YFP-BET12- m (рис. 4A, красным). Поразительно, что YFP-BET12- m обнаруживает доминантный паттерн ER и колокализуется с CNX-RFP (Fig. 4C), указывая тем самым, что мутации сильно ингибируют его экспорт в ER. Интересно, что несколько точек со слабыми сигналами флуоресценции были локализованы рядом с ER, предполагая, что ограниченное количество YFP-BET12- m все еще может выходить из ER и достигать Гольджи (рис.4С; Рис. S4). Нарушение экспорта YFP-BET12- m в ER наблюдалось не только в протопластах, но и в интактных проростках Arabidopsis ; YFP-BET12 и YFP-BET12- m экспрессировали в 7-дневных проростках путем бомбардировки частицами, и соответствующие трансформированные клетки отображали с помощью CLSM. В выстилке листа и в клетках трихом YFP-BET12 обнаруживает точечный узор, напоминающий локализацию Гольджи (Fig. 4D). Напротив, YFP-BET12- m демонстрирует структуру сети ER как в выстилке листа, так и в клетках трихома, что, очевидно, наблюдалось во всей проекции стопки z нескольких конфокальных слоев (рис.4E). Точечный мутагенез пяти остатков значительно изменил локализацию YFP-BET12 с точки на паттерн ER. Тот факт, что есть два предполагаемых COPII-связывающих мотива в разных регионах белка, может объяснить наше вышеупомянутое наблюдение, что отсутствие какого-либо одного сигнала экспорта ER приводит как к паттерну локализации точки, так и к ER.

Рис. 4.

Сигнальные мотивы, идентифицированные в разных регионах, важны для нацеливания YFP – BET12 как в протопласте Arabidopsis , так и в растениях. (A) Аминокислотная последовательность, показывающая предполагаемый COPII-связывающий мотив (синий) BET12 и целевой мутагенез в остатки аланина (красный) в BET12- m , с их соответствующей субклеточной локализацией, указанной справа. (B, C) Конфокальные изображения, показывающие точечный узор (B) YFP-BET12 и (C) совместную локализацию YFP-BET12- m с CNX-RFP в протопластах Arabidopsis . Правая панель — это 4-кратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией.Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ), где значение r p , равное +1,0, представляет полную колокализацию. Масштабные линейки: 10 мкм. (D, E) Конфокальные изображения, показывающие структуру субклеточного распределения (D) YFP-BET12 и (E) YFP-BET12- m в проростках Arabidopsis . Мутация предполагаемого COPII-связывающего мотива BET12 сместила его локализацию с (D) точечного паттерна (YFP-BET12) на (E) ER-паттерн сети (YFP – BET12- m ) в обоих листовых покрытиях (три левых). столбцы) и трихомные клетки (правый столбец).В третьем столбце показано 4-кратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Масштабные линейки: 10 мкм.

Рис. 4.

Сигнальные мотивы, идентифицированные в отдельных регионах, важны для нацеливания YFP-BET12 как в протопласте Arabidopsis , так и в растениях. (A) Аминокислотная последовательность, показывающая предполагаемый COPII-связывающий мотив (синий) BET12 и целевой мутагенез в остатки аланина (красный) в BET12- m , с их соответствующей субклеточной локализацией, указанной справа.(B, C) Конфокальные изображения, показывающие точечный узор (B) YFP-BET12 и (C) совместную локализацию YFP-BET12- m с CNX-RFP в протопластах Arabidopsis . Правая панель — это 4-кратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Степень колокализации была определена количественно и представлена ​​коэффициентом корреляции Пирсона (r p ), где значение r p , равное +1,0, представляет полную колокализацию. Масштабные линейки: 10 мкм. (D, E) Конфокальные изображения, показывающие структуру субклеточного распределения (D) YFP-BET12 и (E) YFP-BET12- m в проростках Arabidopsis .Мутация предполагаемого COPII-связывающего мотива BET12 сместила его локализацию с (D) точечного паттерна (YFP-BET12) на (E) ER-паттерн сети (YFP – BET12- m ) в обоих листовых покрытиях (три левых). столбцы) и трихомные клетки (правый столбец). В третьем столбце показано 4-кратное увеличение рамки, обведенной пунктирной линией. Масштабные линейки: 10 мкм.

Предыдущее исследование показало, что MEMB12 участвует в регуляции секреции антимикробного белка PR1 в Arabidopsis (Zhang et al., 2011б) . Поскольку было показано, что BET12 взаимодействует с MEMB12, мы решили проверить, будет ли BET12 также влиять на секрецию PR1. При временной экспрессии PR1-RFP в протопластах Arabidopsis мы не смогли обнаружить какой-либо сигнал внутриклеточной флуоресценции с помощью конфокальной микроскопии. Мы предположили, что большая часть PR1-RFP секретируется в культуральную среду. Поэтому, чтобы доказать эту гипотезу, мы отделили протопласты от культуральной среды с помощью низкоскоростного центрифугирования. Затем собранную культуральную среду концентрировали и из осадка протопласта экстрагировали все белки.Затем как среду, так и белковые экстракты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против RFP. Как и ожидалось, полоса была обнаружена в средней фракции, но не в белках, экстрагированных из осадка (фиг. 6A, дорожки 1, 2), что позволяет предположить, что PR1-RFP постоянно секретируется из протопластов. Интересно, что совместная экспрессия PR1-RFP с YFP-BET12 или YFP-MEMB12 приводила к внутриклеточному накоплению PR1-RFP, о чем свидетельствует обнаружение полос во фракции осадка (рис. 6A, дорожки 4, 6), хотя большинство PR1-RFP все еще секретировался в среду (рис.6А, дорожки 3, 5). Количества PR1-RFP, удерживаемого внутриклеточно и секретируемого внеклеточно, были определены количественно (Fig. 6B), показывая, что эктопическая экспрессия YFP-BET12 и YFP-MEMB12 влияет на трафик PR1. Анализ CLSM с использованием проростков Arabidopsis , экспрессирующих PR1-RFP, был проведен для дальнейшего подтверждения его секреционного поведения. Когда PR1-RFP экспрессировался отдельно, PR1-RFP обнаруживал сигнал флуоресценции во внеклеточном пространстве, окружающем клетку выстилки листа (Fig. 6C). В соответствии с этим коэкспрессия PR1-RFP с YFP-BET12 влияет на трафик PR1-RFP, поскольку внутри клетки обнаруживаются красные фокусы флуоресценции, в то время как некоторое количество PR1-RFP все еще секретируется в апопласт (рис.6D). Чтобы дополнительно проверить взаимосвязь между избыточной экспрессией BET12 и трафиком PR1, мы повторили анализ секреции с постепенным увеличением экспрессии HA-BET12 и определили его влияние на трафик PR1, выполнив иммуноблот-анализ. Чем больше количество HA-BET12, тем больше PR1-RFP захватывается фракцией гранул (Fig. 6E), указывая тем самым, что эффект HA-BET12 на внутриклеточное накопление PR1 зависит от дозировки. Интересно, что сверхэкспрессия HA-BET12- m также препятствовала секреции PR1 и вызывала его внутриклеточную задержку, хотя и в меньшей степени, чем HA-BET12 (рис.S6). Взятые вместе, как биохимический анализ, так и данные визуализации in vivo предполагают, что эктопическая экспрессия BET12 влияет на трафик PR1 и вызывает его внутриклеточное накопление.

Рис. 6.

Эктопическая экспрессия BET12 и MEMB12 влияет на трафик PR1-RFP в протопластах и ​​растениях Arabidopsis . (A) Анализ секреции, показывающий внутриклеточное накопление PR1-RFP при совместной экспрессии с YFP-BET12 и YFP-MEMB12 в протопластах Arabidopsis .Общие белки экстрагировали из протопластов (P) и культуральной среды (M) для клеток, которые (I) отдельно экспрессировали PR1-RFP, (II) совместно экспрессировали PR1-RFP с YFP-BET12 и (III) совместно экспрессировали PR1 – RFP с YFP – MEMB12, соответственно, с последующим анализом иммуноблоттинга (IB) с использованием антител против RFP. Антитела против GFP использовали для обнаружения экспрессии YFP-BET12 и YFP-MEMB12. Окрашивание Ponceau S использовали в качестве эталона загрузки для количественной оценки относительного содержания белков PR1 среди этих трех образцов с использованием ImageJ (показано ниже на блоте).Относительное содержание общих белков PR1 из однократно экспрессируемого образца PR1-RFP (I) было установлено равным 1,00. (B) Количественная оценка (среднее ± стандартное отклонение) процента PR1-RFP, секретированного в культуральную среду для I-III для экспериментов, показанных на A. Для получения результатов количественной оценки были выполнены три независимых эксперимента. (C) Конфокальные изображения, показывающие секрецию PR1-RFP во внеклеточное пространство у проростков Arabidopsis . Рамка, обведенная пунктирной линией, увеличена в 4 раза.Звездочка представляет собой внутриклеточную область клетки выстилки листа. Масштабная линейка: 10 мкм. (D) Конфокальные изображения, показывающие внутриклеточную задержку и внеклеточную секрецию PR1-RFP в проростках Arabidopsis при совместной экспрессии с YFP-BET12. Сигналы PR1 – RFP обнаруживались как внутри, так и вне клетки. Рамка, обведенная пунктирной линией, увеличена в 4 раза. Звездочка обозначает внутриклеточную область тротуарной клетки. Масштабная линейка: 10 мкм. (E) Анализ секреции, показывающий внутриклеточное накопление PR1-RFP при сверхэкспрессии HA-BET12, зависит от дозировки.Общие белки экстрагировали из протопластов, коэкспрессирующих PR1-RFP с увеличивающимся количеством HA-BET12 (от 1 до 3), с последующим иммуноблот-анализом с использованием антител против RFP и HA. Анти-cFBPase использовали в качестве контроля нагрузки. Эксперимент повторяли трижды, каждый из которых показал аналогичные результаты. (F) Анализ роста бактерий, показывающий, что трансгенные растения YFP-BET12 не были ни восприимчивыми, ни устойчивыми к инфекции патогенами. 4-недельные трансгенные растения дикого типа и YFP-BET12 инфильтрировали Pst (DC3000) (1 × 10 6 КОЕ / мл) и Pst (avrRpt2) (5 × 10 6 КОЕ / мл). мл).Рост обоих штаммов Pst измеряли через 0 и 3 дня после инокуляции (dpi). Результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. получается из восьми листовых дисков. Аналогичные результаты были получены в трех биологических повторностях.

Рис. 6.

Эктопическая экспрессия BET12 и MEMB12 влияет на трафик PR1-RFP в протопластах и ​​растениях Arabidopsis . (A) Анализ секреции, показывающий внутриклеточное накопление PR1-RFP при совместной экспрессии с YFP-BET12 и YFP-MEMB12 в протопластах Arabidopsis .Общие белки экстрагировали из протопластов (P) и культуральной среды (M) для клеток, которые (I) отдельно экспрессировали PR1-RFP, (II) совместно экспрессировали PR1-RFP с YFP-BET12 и (III) совместно экспрессировали PR1 – RFP с YFP – MEMB12, соответственно, с последующим анализом иммуноблоттинга (IB) с использованием антител против RFP. Антитела против GFP использовали для обнаружения экспрессии YFP-BET12 и YFP-MEMB12. Окрашивание Ponceau S использовали в качестве эталона загрузки для количественной оценки относительного содержания белков PR1 среди этих трех образцов с использованием ImageJ (показано ниже на блоте).Относительное содержание общих белков PR1 из однократно экспрессируемого образца PR1-RFP (I) было установлено равным 1,00. (B) Количественная оценка (среднее ± стандартное отклонение) процента PR1-RFP, секретированного в культуральную среду для I-III для экспериментов, показанных на A. Для получения результатов количественной оценки были выполнены три независимых эксперимента. (C) Конфокальные изображения, показывающие секрецию PR1-RFP во внеклеточное пространство у проростков Arabidopsis . Рамка, обведенная пунктирной линией, увеличена в 4 раза.Звездочка представляет собой внутриклеточную область клетки выстилки листа. Масштабная линейка: 10 мкм. (D) Конфокальные изображения, показывающие внутриклеточную задержку и внеклеточную секрецию PR1-RFP в проростках Arabidopsis при совместной экспрессии с YFP-BET12. Сигналы PR1 – RFP обнаруживались как внутри, так и вне клетки. Рамка, обведенная пунктирной линией, увеличена в 4 раза. Звездочка обозначает внутриклеточную область тротуарной клетки. Масштабная линейка: 10 мкм. (E) Анализ секреции, показывающий внутриклеточное накопление PR1-RFP при сверхэкспрессии HA-BET12, зависит от дозировки.Общие белки экстрагировали из протопластов, коэкспрессирующих PR1-RFP с увеличивающимся количеством HA-BET12 (от 1 до 3), с последующим иммуноблот-анализом с использованием антител против RFP и HA. Анти-cFBPase использовали в качестве контроля нагрузки. Эксперимент повторяли трижды, каждый из которых показал аналогичные результаты. (F) Анализ роста бактерий, показывающий, что трансгенные растения YFP-BET12 не были ни восприимчивыми, ни устойчивыми к инфекции патогенами. 4-недельные трансгенные растения дикого типа и YFP-BET12 инфильтрировали Pst (DC3000) (1 × 10 6 КОЕ / мл) и Pst (avrRpt2) (5 × 10 6 КОЕ / мл). мл).Рост обоих штаммов Pst измеряли через 0 и 3 дня после инокуляции (dpi). Результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. получается из восьми листовых дисков. Аналогичные результаты были получены в трех биологических повторностях.

PR1 известен как антимикробный белок, который играет важную роль в иммунитете растений (Van Loon and Van Strien, 1999). Поскольку эктопическая экспрессия YFP-BET12 мешает трафику PR1, чтобы проверить, затронута ли антибактериальная защита, мы выполнили анализы роста бактерий с использованием дикого типа и трансгенных растений, сверхэкспрессирующих YFP-BET12, инфицированных как вирулентными, так и авирулентными ( avrRpt2 ) штаммами бактериальный возбудитель Pseudomonas syringae pv. помидор ( Pst DC3000) . Анализы роста бактерий показали, что не было значительной разницы в росте вирулентных или авирулентных штаммов Pst при сравнении растений дикого типа и растений со сверхэкспрессией YFP-BET12 (рис. 6F), что позволяет предположить, что трансгенные растения YFP-BET12 не являются более восприимчивы к инфекции возбудителя.

Множественные механизмы нацеливания на мембранные белки были предложены у растений, включая распознавание различных сигнальных мотивов механизмами доставки, а также различные свойства TMD (Brandizzi et al., 2002; Лангханс и др., 2008; Робинсон и др., 2007; Рохо и Денеке, 2008; Schoberer et al., 2009; Wang et al., 2014). Однако механизмы нацеливания для большинства SNAREs в предназначенные для них компартменты остаются неясными для растений. Сообщалось, что целые лонгичные домены VAMP7 SNAREs и двухкислый мотив SYP31 важны для нацеливания на вакуолярный и Гольджи, соответственно (Chatre et al., 2009; Uemura et al., 2005). Однако дополнительные факторы и природа механизма торговли людьми, задействованного в нацеливании на SNARE, неизвестны.В этом исследовании мы продемонстрировали локализацию Golgi и TGN Qc-SNARE BET12 в Arabidopsis и выявили его COPII-зависимый механизм экспорта ER. Интересно, что исследования субклеточной локализации BET12 с использованием трансгенных растений и протопластов дали результаты с незначительным расхождением: YFP-BET12 был более локализован в TGN в клетках корней трансгенных растений, тогда как YFP-BET12 показал немного более высокую скорость совместной локализации с Golgi, чем маркер TGN. в протопластах. Это изменение может быть связано с различными методологиями (иммуномечение и временная экспрессия) и растительным материалом (трансгенные растения и протопласты), используемым для исследований локализации.Предыдущие исследования показали, что длина TMD вряд ли является единственным детерминантом, который диктует субклеточную локализацию белков SNARE (Chatre et al., 2009; Uemura et al., 2005). Это согласуется с нашими находками, показывающими, что одного присутствия TMD BET12 недостаточно для его экспорта в ER (Fig. 2). Сообщалось, что ортолог млекопитающих BET1 крысы (rBET1) зависит от своего мотива SNARE для нацеливания (Joglekar et al., 2003). Однако отсутствие мотива BET12 SNARE не влияло на его экспорт в ER в клетках Arabidopsis .Вместо этого с помощью экспериментов по усечению мы идентифицировали два участка, которые содержат сигнальные мотивы, ответственные за эффективный экспорт BET12 в ER: N-конец (aa 1–32) и область между мотивом SNARE и TMD (aa 98– 106). Экспорт BET12 ER затруднен, но не отменен полностью, удалением одного из участков, содержащих сигнальный мотив (либо aa 1–32, либо aa 98–106), что подтверждается наблюдением паттерна локализации как ER, так и точечного (Гольджи). усеченного YFP – BET12 (рис.2). В самом деле, подобные экспериментальные подходы были применены для выяснения механизма нацеливания др. Локализованного по Гольджи SNARE SYP31. Новый двухкислый мотив ExxD, находящийся в области между спиралями SNARE, как было обнаружено, облегчает экспорт SYP31 в ER (Chatre et al., 2009). Для точной идентификации аминокислотных остатков, составляющих сигнальные мотивы для экспорта BET12 ER и задействованного механизма переноса, были выполнены эксперименты по мутагенезу и раскрытию. Эксперименты по раскрытию синтетических пептидов показали, что Sar1, один из основных компонентов образования везикул COPII, может взаимодействовать с областью между мотивом SNARE и TMD (a.а. 98-106) (рис.3). В соответствии с этим путем анализа последовательности мы обнаружили, что наличие двухосновного мотива, который, как сообщается, является связыванием Sar1 (Giraudo and Maccioni, 2003; Srivastava et al., 2012; Yuasa et al., 2005), в том же область, край. Было показано, что мутации остатков двухосновных мотивов, проксимальных к TMD bZIP28, в остатки аланина препятствуют его взаимодействию с Sar1 и ингибируют его экспорт в ER при стрессе ER (Srivastava et al., 2012). Кроме того, консервативный мотив LxxLE в дрожжевом Bet1, который связывается с B-сайтом комплекса Sec23-Sec24 (Mossessova et al., 2003), был идентифицирован в N-концевой области BET12 (а.о. 1–32). Хотя не сообщалось о прямом взаимодействии между SNAREs и Sec24 у растений, было показано, что Sec24 взаимодействует с калиевым каналом KAT1 посредством своего двухкислотного мотива и способствует его экспорту в ER (Sieben et al., 2008). Независимый мутагенез предполагаемого Sec24-связывающего мотива LxxLE (а.о. 18–22) и Sar1-связывающего двухосновного мотива RK (а.о. 102–103) в остатки аланина приводит к частичному нарушению экспорта BET12 в ER (рис.S3). Одновременный мутагенез всех пяти остатков серьезно ингибировал трафик BET12, что привело к локализации YFP-BET12- m в ER (рис. 4), а также к эффекту захвата ER при коэкспрессии с Sar1C-DN– RFP. Эти данные указывают на то, что экспорт BET12 в ER зависит от сигнального мотива и опосредуется функциональным механизмом COPII.

Сообщается, что в дополнение к COPII, аппаратный компонент COPI Arf1 взаимодействует с другим локализованным по Гольджи SNARE, MEMB11 (Marais et al., 2015). Было высказано предположение, что мембрин (также известный как GOSR2), MEMB11 млекопитающих, действует как рекрутер для рекрутирования Arf1 на мембрану Гольджи, чтобы инициировать образование пузырьков COPI (Honda et al., 2005). EMP12, как было показано, взаимодействует с механизмом COPI, чтобы поддерживать свою локализацию по Гольджи (Gao et al., 2012). Интересно, что определенные компоненты механизмов COPI были идентифицированы в наших раскрывающихся данных MS / MS (Fig. 3), предполагая, что BET12 может также связываться с COPI и включаться в везикулы COPI для своего надлежащего нацеливания.

Сообщалось, что нарушение трафика и неправильное нацеливание белков SNARE является пагубным для клеток. Например, правильный перенос KNOLLE важен для цитокинеза растительных клеток (Park et al., 2013; Reichardt et al., 2007), в то время как снижение солеустойчивости может быть вызвано частичной неправильной локализацией SYP61 у мутантов tno1 ( Ким и Бэшем, 2011). Чтобы определить, есть ли какой-либо неблагоприятный клеточный эффект, вызванный формой BET12, дефектной по экспорту ER, мы наблюдали за перемещением как растворимых, так и мембранных белков, которые, как известно, используют секреторный путь ER-to-Golgi.Однако не наблюдалось никаких дефектов транспорта, поскольку и Aleurain-mRFP, и RFP-SCAMP1 транспортировались в свои соответствующие предназначенные компартменты, и даже YFP-BET12- m был в значительной степени захвачен в ER (Fig. S4). Интересно, что сообщается, что сверхэкспрессия формы SYP31, дефектной по экспорту ER, серьезно подавляет рост растений табака (Melser et al., 2009), поскольку накопление захваченного ER SYP31 токсично для секреторного пути, потенциально нарушая гомеостаз механизма SNARE, а также интерфейса ER – Golgi.Хотя на транспорт белков не влияла избыточная экспрессия YFP-BET12- m , дефектный экспорт BET12 в ER может улавливать взаимодействующий партнер SNARE вместе в ER. Среди проанализированных локализованных по Гольджи SNAREs только MEMB12 оказался захвачен в ER при совместной экспрессии с YFP-BET12- m (Fig. 5) . Bos1, дрожжевой гомолог MEMB12, не имеет никакого Sec24-связывающего мотива (Mossessova et al., 2003). В отличие от других локализованных по Гольджи SNARE, которые могут связываться с Sec24 для их экспорта в ER, вполне вероятно, что Bos1 связывается со своими партнерскими SNARE с образованием комплекса, который затем совместно упаковывается в везикулы COPII для экспорта ER (Mossessova et al., 2003). Подобно его ортологу Bos1, никакой предполагаемый мотив связывания Sec24 не может быть идентифицирован в MEMB12, указывая тем самым, что его экспорт в ER может зависеть от его партнера SNARE. В этом смысле удерживание ER YFP-BET12- m , которое взаимодействует с MEMB12, может также приводить к дефектному экспорту ER MEMB12. Интересно, что недавнее исследование показало, что предварительно собранный тройной комплекс Golgi Q-SNARE был предпочтительным для экспорта ER в клетках млекопитающих, это открытие подтверждается дефектом сортировки, присутствующим во всех других Q-SNARE при мутации сайта связывания для Sec24C– Синтаксин 5 (Adolf et al., 2016). В нашем исследовании ниспадающий анализ с последующим анализом MS / MS не смог идентифицировать потенциальных партнеров SNARE, взаимодействующих с BET12, вероятно, из-за того, что только определенная область (aa 98-106) BET12, но не его спиральная спираль SNARE домен был использован в качестве приманки для анализа. В самом деле, в исследовании in vitro было показано, что BET12 предпочтительно формирует комплекс SNARE с дрожжевым Bos1 и некоторыми SNARE Гольджи (Tai and Banfield, 2001). Аналогичные анализы связывания in vitro с использованием очищенных белков SNARE Arabidopsis могут представлять собой хороший подход для идентификации партнеров SNARE BET12.Характеристика взаимодействующего домена между BET12 и MEMB12, а также использование in vitro анализов почкования для определения того, совместно ли BET12 и MEMB12 упакованы в пузырьки, безусловно, пролили бы свет на механизм экспорта белков SNARE в ER.

Об участии локализованного по Гольджи SNARE MEMB12 в защите растений против патогенов сообщалось ранее (Zhang et al., 2011b). Arabidopsis Нокаут-мутанты MEMB12 проявляют повышенную устойчивость к бактериальному патогену Pst , поскольку отсутствие MEMB12 способствует экзоцитозу антимикробного белка PR1 (Zhang et al., 2011b). В соответствии с его ролью в качестве негативного регулятора секреции PR1 мы обнаружили в нашем исследовании, что избыточная экспрессия MEMB12 вызывает внутриклеточное накопление PR1. Интересно, что эктопическая экспрессия BET12 влияет на трафик PR1 точно так же, как и MEMB12. Хотя трафик PR1 был затронут, трансгенные растения, сверхэкспрессирующие BET12, не показали значительных различий в устойчивости к инфекции Pst (рис.6), вероятно, из-за того, что количество секретируемого PR1 для защиты существенно не уменьшилось. Известно, что белки SNARE играют важную роль в защите растений (Assaad et al., 2004; Collins et al., 2003; Kwon et al., 2008; Uemura et al., 2012a; Wang et al., 2016). Примечательно, что предыдущее исследование выявило важную роль секреторного пути растения для иммунитета растений, поскольку мутанты компонента секреторного пути показали пониженную секрецию PR1 и были восприимчивы к бактериальному патогену (Wang et al., 2005). В другом исследовании сообщается, что локализованный в плазматической мембране SNARE SYP132 подвергается фосфорилированию после обработки элиситором и эффективная секреция PR1 зависит от SYP132 (Kalde et al., 2007).

Растущие данные свидетельствуют о том, что отсутствие определенных белков или секреторных компонентов SNARE делает растения более восприимчивыми к патогенам; наше открытие, что присутствие BET12 и MEMB12 играет репрессивную роль в секреции PR1, может поэтому показаться противоречивым.Было высказано предположение, что MEMB12 участвует в ретроградном переносе белков из Golgi обратно в ER, таким образом, PR1 может рециклироваться обратно и вместо того, чтобы секретироваться (Zhang et al., 2011b). Поскольку BET12 демонстрирует взаимодействие с MEMB12, кажется разумным, что сверхэкспрессия BET12 будет ингибировать секрецию PR1, способствуя его ретроградному транспорту. Хотя мы не можем исключить эту возможность, возможным альтернативным объяснением может быть избыток белков SNARE, присутствующий из-за сверхэкспрессии. Избыток белков SNARE может привести к неконтролируемому взаимодействию партнеров SNARE и, таким образом, нарушить гомеостаз механизмов SNARE.Было высказано предположение, что белки SNARE могут стать нефузогенными при чрезмерном накоплении, и эти SNARE называются ингибирующими SNARE (i-SNAREs) (Di Sansebastiano, 2013), о чем свидетельствует исследование с использованием анализа in vitro слияния ( Варламов и др., 2004). И дрожжевые, и крысиные ортологи BET12, Bet1 и rBET1 обнаруживают ингибирующий эффект на слияние SNARE в избытке (Varlamov et al., 2004). Предыдущее исследование растений показало, что SYP51 и SYP52 действуют как i-SNARE и влияют на перемещение вакуолей, когда они накапливаются на тонопласте (De Benedictis et al., 2013). В этом смысле, учитывая наш результат по трафику PR1, вполне вероятно, что сверхэкспрессия BET12 может действовать как i-SNARE в раннем секреторном пути и, следовательно, предотвращает слияние PR1-содержащих везикул и, таким образом, ингибирует его секрецию. Интересно, что сверхэкспрессия локализованных по Гольджи SNAREs SYP31 и MEMB11 сильно ингибирует антероградный транспорт из ER в Golgi, о чем свидетельствует перераспределение Man1-RFP в ER (Bubeck et al., 2008). Примечательно, что сверхэкспрессия BET12 не влияла на распределение Man1-RFP (рис.2A), указывая на то, что общий путь антероградного транспорта не нарушается BET12. Вместо этого нарушается трафик PR1, что указывает на потенциальную роль BET12 в регуляции секреции белков, связанных с патогенезом, и иммунитета растений. Дальнейшие исследования, объединяющие анализ слияния in vitro и SNARE с мониторингом трафика in vivo , помогут охарактеризовать активность i-SNARE в растениях. Это также откроет возможность того, что, помимо хорошо известной фузогенной роли белков SNARE, регулирование и нацеливание нефузогенных SNARE на компартменты может точно настраивать перенос белков в ответ на различные стрессовые условия.

Недавно сообщалось, что одиночные гомозиготные bet11 или bet12 инсерционные мутанты Т-ДНК не проявляют очевидного вегетативного фенотипа. У гомозиготных и гетерозиготных двойных мутантов bet11 / bet12 (и наоборот) наблюдался пониженный набор семян, что, вероятно, вызвано дефектным ростом пыльцевых трубок (Bolanos-Villegas et al., 2015). Эти результаты предполагают, что функции BET11 и BET12 могут частично перекрываться, поскольку сообщалось о функциональной избыточности между членами семейства SNARE (Kim and Bassham, 2013; Shirakawa et al., 2010; Uemura et al., 2010). Дальнейшие исследования с использованием двойных мутантов bet12 или bet11 / bet12 в ответе патогена, безусловно, помогут выяснить роль SNARE ER-to-Golgi в ​​иммунитете растений.

Введение в контроль качества Netflix (QC) — Netflix

Введение в контроль качества Netflix

Назначение:

В этом документе представлен обзор трех различных типов контроля качества в Netflix.Цель состоит в том, чтобы предоставить нашим партнерам по доставке понимание наших процессов контроля качества. В этом документе также описываются типичные сбои активов и предоставляется дополнительный контекст для запросов на повторную доставку Backlot, что является отражением нашей приверженности обеспечению высокого качества обслуживания клиентов.

Типы контроля качества:
  • Операции контроля качества
    • Обязанности: Защищает клиентский опыт для всего контента. Проверяет перекодированный материал во внутреннем веб-плеере.
  • Брендированный контент QC
    • Обязанности: Обеспечивает максимально возможное качество фирменного контента Netflix. Проверяет техническое качество и согласованность содержимого аудио- и видеоресурсов.
  • Контроль качества локализации
    • Обязанности: Обеспечивает согласованность руководств по стилю и перевода. Исследует исходные файлы в нашем внутреннем инструменте Subtitle Originator с целью обеспечения наилучшего качества.

Операции контроля качества

QC Operations определяет проблемы, которые могут помешать потоковой передаче.Команда QC Operations применяет подход к моделированию клиентского опыта. В фокусе:

  • Проблемы, препятствующие потреблению (например, доставка неверного контента)
  • Проблемы, заметно снижающие качество заголовка (проблемы с переводом, опечатки, артефакты видео)
  • Учитывать лицензионный контент (разные стили)

Доставка и прием:

Процесс доставки / приема контента, проходящего через операции контроля качества, состоит из трех этапов: загрузка актива, автоматический контроль качества / проверка как услуга (IaaS) и ручной контроль качества.Следующая блок-схема иллюстрирует этот процесс:

Типы проверок операций по контролю качества:

  • Точечный контроль качества:
    • Первые 2 минуты
    • 1 минута: Найдите кредиты
    • 1 мин .: 50%
    • 1 мин .: 75%
    • Последние 2 минуты
    • Включает выборочную проверку по телефону:
    • Выполнено для активов с более низкой прогнозируемой популярностью

  • Полный контроль качества:
    • Все активы проверены
    • Выполнено для оригиналов Netflix и высокопрофессионального контента


Ошибки контроля качества в общем каталоге:

Брендированный контент QC

Фирменный контент QC проверяет качество исходных активов на соответствие нашим спецификациям доставки оригиналов Netflix и проверяет согласованность контента.Контроль качества брендированного контента выполняется исключительно в отношении брендированного контента Netflix. Операторы контроля качества брендированного контента выполняют несколько полных линейных проверок активов и отмечают проблемы, несовместимые с контекстом программы.

Контроль качества брендированного контента выполняется для следующих типов ресурсов в единой среде (например, 4K просматривается в 4K; HD просматривается в HD; Atmos отслеживается в массиве динамиков Atmos):

  • Первичный A / V IMF
  • 5.1 Музыка и эффекты Аудио
  • 5.1 Printmaster Audio
  • Аудио Atmos

Выписка чеков

Коды проблем контроля качества брендированного контента можно разделить на следующие категории:

  • Технические проблемы: , состоящие из проблем кадрирования, проблем с соотношением сторон, уровней изображения, громкости звука, пиковых уровней, форматирования и т. Д.
  • Проблемы с контентом: , состоящие из видимого производственного оборудования и экипажа, битых пикселей, выпавших / повторяющихся кадров, звуковых тиков / тресков, сожженных субтитров и т. Д.

В конечном итоге QC брендированного контента проверяет и отмечает несоответствия, возникающие в процессе производства и постпроизводства. Проблемы проверяются при полном линейном контроле качества и при необходимости покадрово.

Партнеры по контролю качества фирменного контента

Фирменный контент Netflix проходит контроль качества проверенным партнером по контролю качества фирменного контента Netflix после доставки в Netflix. Все коды ошибок и отчеты проверяются, чтобы подтвердить возможность устранения проблемы. Отчеты, требующие принятия мер, отправляются обратно в службы доставки и отправки для устранения проблем.

Зачем нужен контроль качества брендированного контента?
  • Отметить проблемы, которые могут негативно повлиять на качество обслуживания клиентов
  • Отметить проблемы, которые отвлекают от исходного творческого замысла. Маловероятно, что микрофон на штанге, метка ленты или член съемочной группы должны были быть в кадре.
  • Обеспечьте соответствие спецификациям доставки оригиналов Netflix и техническим стандартам.

Общие проблемы контроля качества брендированного контента (без ранжирования):
  1. Ошибка пикселей
  2. Ошибка анимации
  3. Ошибка края кадра
  4. Видимое производственное оборудование
  5. Проблемы с метаданными Dolby Vision
  6. Ошибки VFX
  7. Audio Tick / Pop
  8. Сдвиг яркости
  9. Синхронизация эффектов в M&E
  10. Отсутствующие эффекты в M&E

* Полный список кодов проблем контроля качества фирменного контента см. В разделе «Код проблемы контроля качества» Справочного центра для партнеров или в этом полезном документе по процессу «Примечания к исправлению»

Отчеты о контроле качества — Рейтинги серьезности кода проблемы и меры:
  • FYI — То, на что мы хотели бы обратить внимание, не обязательно является проблемой — Не запускает запрос на повторную доставку — Никаких действий не требуется, но при желании можно применить исправления.
  • Проблема — Субъективные проблемы, которые могут не быть обнаружены заказчиком (субъективный перевод и потенциальные проблемы с произношением) ИЛИ объективные проблемы с техническими аспектами файла, которые клиенты заметят (проблемы, которые могут отрицательно повлиять на качество и / или не сохранять творческий замысел) — Запустит запрос на повторную доставку — Команда публикации должна проверить и указать, какие действия они предпримут по проблеме.
  • Блокировщик — Проблемы, из-за которых файл не может быть использован или очень плохо отражается на Netflix (неправильный язык, отсутствие дубликатов, синхронизация времени, оскорбительный / уничижительный язык) — вызывает запрос на повторную доставку — Post or Delivery команда должна исправить и повторно отправить перед запуском .


Контроль качества локализации

Localization QC определяет качество перевода, согласованность и соответствие руководству по стилю. Этот процесс включает в себя проверку оператором QC синхронизированного текстового ресурса, внедрение изменений и категоризацию обоснования изменений.

Контроль качества локализации выполняется на следующих типах активов:

  • Субтитры
  • SDH / скрытые титры

Рабочий процесс контроля качества локализации — инициатор субтитров

Синхронизированные текстовые ресурсы проходят контроль качества в нашем фирменном инструменте Subtitle Originator.События с синхронизированными текстовыми сообщениями выстраиваются в линию с формами сигналов для проверки синхронизации и выполнения контроля качества.

Исправления в синхронизированном текстовом файле вносятся непосредственно в инструменте, и изменения передаются обратно автору и / или партнеру по исполнению в форме отчета о контроле качества локализации в инициаторе субтитров (если у партнера есть доступ) и резервной памяти:

Создатель субтитров:

Щелчок по значку отчета предоставит доступ к Журналу изменений. В журнале изменений подробно описаны все исправления, которые оператор контроля качества локализации внес в этот файл, а также категории ошибок, как показано ниже:

Мест для размещения:

После этой «ссылки на отчет QC локализации» будет предоставлен доступ к журналу изменений.В журнале изменений подробно описаны все исправления, которые Оператор контроля качества внес в этот файл, как показано ниже:

Контроль качества локализации — Оценка показателей:

Коэффициенты ошибок для каждого типа активов определяются следующим образом.

  • Частота ошибок субтитров:
    • Событий с ошибками / всего Кол-во событий
  • Частота языковых ошибок:
    • События с ошибками трансляции / всего Кол-во событий
  • Частота технических ошибок:
    • Событий с техническими ошибками / всего Кол-во событий
  • Частота ошибок звука:
    • Количество звуковых флагов / общее время работы


Общие ошибки контроля качества при локализации:
  1. SGP (орфография, грамматика и пунктуация)
  2. Объективный перевод
  3. Субъективный перевод
  4. Синхронизация со звуком
  5. Скорость чтения



• Загрузить PDF — английский

Эта статья была полезной? 94 из 109 нашли это полезным

QC Прошлое, настоящее и будущее

Те, кто не извлекают уроки из прошлого, обречены повторять его.Это высказывание применимо как к практике контроля качества, так и к урокам истории. На съезде AACC / ASCLS 2011 г. доктор Вестгард рассмотрел историю контроля качества в лабораториях, а также существующие проблемы и возможные варианты будущего.

Исторический взгляд на лабораторный контроль качества: где мы были и куда идем!

Джеймс О. Вестгард, доктор философии

Сентябрь 2011 г.

На Национальном собрании AACC / ASCLS в Атланте в 2011 году я представил краткую историю контроля качества на семинаре Bio-Rad на тему «Контроль качества в будущем.«Я подумал, что людям это может показаться довольно скучным, но был удивлен, что многие современные лабораторные ученые не знают, откуда взялся QC и как он был адаптирован к изменениям в технологиях. Эта история важна для того, чтобы вести нас в будущее и не дать нам снова повторить те же ошибки. Например, во время выставок мы получили ряд вопросов от ученых-лаборантов по поводу некоторых презентаций и плакатов по КК. Одно касалось приложений контроля качества при мультиплексном тестировании, а другое касалось использования 2-х контрольных пределов и практики повторения контроля.При решении этих проблем можно руководствоваться решениями прошлых проблем с одновременным анализом нескольких тестов. Мы вернемся к этим конкретным проблемам в более поздних обсуждениях, но сейчас время для истории!

Вначале был Шухарт!

Industrial QC был введен в 1930-х годах Шухартом, который был статистиком в Bell Laboratories. Его классический текст «Экономический контроль качества производимой продукции» содержит теоретические и практические рекомендации по статистическому контролю качества [1].Рекомендованная методика заключалась в том, чтобы выбрать группу продуктов и определить среднее значение и диапазон критических характеристик, поэтому первыми инструментами для SQC на самом деле были диаграммы среднего и диапазона, где среднее значение нескольких измерений было нанесено на диаграмму среднего и диапазона ( разница от максимума до минимума измерений) наносили на диаграмму диапазона. Сегодня этот метод по-прежнему является стандартной практикой в ​​промышленности.

В 1940-х годах Демингу (который одно время работал с Шухартом) было поручено обучить американскую промышленность навыкам SQC, чтобы обеспечить качество продукции военного времени [2].Одной из сильных сторон американского вооружения было качество производства, и SQC стали широко практиковаться в американской промышленности.

В конце 40-х и 1950-х годах Деминга попросили помочь японской промышленности в улучшении качества продукции, особенно телефонов, которые были необходимы для улучшения связи. Кроме того, Джуран начал проводить более широкое обучение управлению качеством [3]. Их усилия привели к появлению принципов и практики Всеобщего управления качеством и постоянного улучшения качества в промышленности.

Пришли Леви и Дженнингс и QC 1-го поколения

Кроме того, в 1950 году два патолога — Леви и Дженнингс — внедрили SQC в медицинских лабораториях [4]. Практика заключалась в использовании образца пациента и проведении повторных измерений. Конечно, среднее значение этих дубликатов сильно варьировалось из-за различий от пациента к пациенту, но диапазон давал меру точности и способ контролировать то, что тогда было строго ручным процессом измерения.

Ограничение из-за вариабельности пациентов было быстро преодолено Генри и Сегаловым, которые в 1952 г. рекомендовали использовать пулы пациентов в качестве контрольных образцов, чтобы получить образец, который был стабильным в течение более длительного времени [5].При наличии стабильного контрольного образца они также рекомендовали использовать отдельные измерения, а не дубликаты, что на самом деле является основой сегодняшней практики «однозначного» контроля качества. Таким образом, хорошо известная диаграмма Леви-Дженнингса на самом деле является адаптацией Генри и Сегалова для использования с единичными контрольными измерениями. Обычной практикой было анализировать один контроль и использовать 2-х контрольные пределы.

Потом была автоматика

В 1960-х годах автоматизация проникла в клинические лаборатории.SQC стал стандартной практикой, и производители начали предоставлять стабильные коммерческие средства контроля для поддержки стандартного лабораторного контроля качества.

Автоанализатор Technicon был изобретен в 1951 году Леонардом Скеггсом, врачом, работавшим с почечным диализом [6]. Поскольку он также работал в клинической лаборатории, он заинтересовался тем, как автоматизировать анализ крови, и его изобретение «диализатора» стало прорывом, позволившим автоматизировать этап разделения белка в процессе тестирования.Хотя в 50-х годах было выпущено относительно немного AutoAnalyzers, они стали стандартом практики в 1960-х, когда лабораторные испытания начали расти.

С автоматизацией контроль качества также стал стандартной практикой. Имейте в виду, что AutoAnalyzer был устройством с непрерывным потоком, а это означало, что в основном это был насос с трубками разного размера для образца и реагентов. Скорость анализа обычно составляла 40 образцов в час, что привело к практике «пакетного тестирования», когда стандарты загружались заранее, затем следовали некоторые контроли, затем пациенты, а в конце цикла — еще контроли.Вы понимаете, что в процессе откачки трубки изнашиваются, что приводит к их дрейфу с течением времени, поэтому контроль партии был важен для мониторинга стабильности испытаний с течением времени, даже в течение относительно короткого времени в час.

Единый тест Автоанализаторы были быстро объединены для автоматизации тестов большого объема (глюкоза и АМК) и электролитов. Вскоре синхронные многоканальные анализаторы (серия SMA от Technicon) стали производственными рабочими лошадками лабораторий. Они выросли в размерах с 6 каналов до 12 до 20 в течение 60-х и 70-х годов.Между тем, в практике контроля качества продолжалось использование контрольных пределов 2 SD, и во многих лабораториях возникли трудности из-за присущей им ложной отбраковки.

Всем известно, что существует вероятность примерно 0,05 или 5% превышения 2 контрольных пределов SD, даже если процесс тестирования работает должным образом. По мере увеличения количества контролей вероятность ложных отказов (P fr ) также увеличивается. Когда 2 контроля, P fr составляет около 0,095 или 9,5%, с 3 контролями около 0.14 или 14%, а с 4 контрольными — 0,18 или 18%. Менее понятен тот факт, что при одновременном анализе количество различных тестовых каналов вызывает один и тот же эффект, поэтому по мере увеличения количества тестовых каналов с системами SMA вероятность ложных отклонений (по крайней мере, на тестовом канале) также увеличивается, таким образом, Производительность анализаторов снижалась из-за необходимости часто повторять хотя бы один тест на панели.

На семинаре Bio-Rad я рассказал историю о том, как понял, что с 20-канальным анализатором и контрольными пределами 1 SD нам почти всегда приходилось повторять хотя бы один тест.Я понял, что если мы увеличим количество контрольных образцов до 2, мы, вероятно, сможем просто продолжать анализировать один исходный набор образцов вечно, что сэкономит много времени и денег, потому что нам никогда не придется собирать больше образцов от пациентов. Предполагалось, что эта история будет шуткой, но мало кто понял, о чем я говорю, что свидетельствует о том, что лаборанты сегодня не знают этой истории (а также показывает, сколько мне лет), и что мы, вероятно, сделаем что-то из этого. снова эти же ошибки (потому что мы не знаем этой истории).Например, текущие трудности с контролем качества для мультиплексного анализа связаны с проблемой ложных отклонений для одновременных измерений.

QC 2-го поколения

В 1976-77 годах, находясь в творческом отпуске в Упсальском университете в Швеции, я начал изучать методы промышленного контроля качества, чтобы понять происхождение лабораторных практик, а также узнать, как их можно улучшить. Только что из опыта работы с анализаторами SMA стало очевидно, что ограничения 2SD необходимо устранить, но что должно их заменить? Стандартной практикой в ​​отрасли было использование пределов 3SD и рассмотрение только 2 SD в качестве правила предупреждения, что также было первоначальной рекомендацией Шухарта.И хотя 3 предела SD позволяют снизить количество ложных отказов, существует опасность того, что обнаружения ошибок может оказаться недостаточно для предполагаемого использования медицинских тестов.

Итак, казалось целесообразным использовать 2 SD в качестве правила предупреждения, 3 SD в качестве правила отклонения, а затем рассмотреть другие правила, которые могут улучшить обнаружение ошибок. С помощью компьютерного моделирования мы смогли охарактеризовать характеристики отклонения большинства правил, используемых в промышленности, а затем рекомендовали способ оптимизации производительности QC, сначала минимизируя количество ложных отклонений, а затем создавая обнаружение ошибок с помощью ряда правил управления. [7].В 1981 г. была опубликована статья, показывающая подробный пример, в которой описывалось использование «диаграммы множественных правил Шухарта» [8].

В 80-е годы многие лаборатории внедрили многократный контроль качества, поскольку автоматизированные системы и лабораторные информационные системы обеспечивали необходимое программное обеспечение для контроля качества. Technicon был первым производителем инструментов, который сделал это и популяризировал название «Правила Вестгарда». Одна из причин широкого применения заключалась в том, что Правила Вестгарда находились в открытом доступе, были опубликованы в научной литературе и подпадали под действие только защиты «авторского права».Это было еще в то время, когда целью университетских исследований было решение проблем, а не защита открытий и разработок с целью зарабатывания денег.

Multirule QC можно рассматривать как QC 2-го поколения для автоматических анализаторов, после QC Levey-Jennings 1-го поколения для ручных методов. Практика заключалась в единообразном использовании многократного контроля качества для всех тестов, точно так же, как контроль качества Леви-Дженнингса применялся единообразно ко всем испытаниям.

QC 3-го поколения

В то же время аналитические системы значительно улучшились.В 80-х DuPont ACA открыла новую эру стабильности для автоматических анализаторов произвольного доступа. Никогда раньше анализаторы не были стабильными в течение целого дня, не говоря уже о многих днях и даже неделях. Несмотря на то, что мы тщательно управляли средствами контроля, основываясь на прошлом опыте, было очевидно, что эта новая аналитическая система требует менее частого контроля, и нам необходимо адаптировать наши методы контроля качества для улучшения технологий. ACA преподал нам этот урок и привел к использованию разных процедур контроля качества в разных аналитических системах.Это было началом усилий по выбору или разработке процедур контроля качества, соответствующих рабочим характеристикам различных аналитических систем и технологий, которые можно было бы рассматривать как КК 3-го поколения.

TQM и QC 4-го поколения

К счастью, система Total Quality Management (TQM) возникла в американской промышленности в 1980-х годах в попытке конкурировать с высококачественной продукцией японской промышленности. Деминг и Джуран теперь возглавляли американскую промышленность по внедрению тех же методов, которые развивались в японской промышленности.Усилия были шире, чем SQC, и особенно подчеркивали ответственность руководства и обязательства по качеству. Качество теперь по-разному определялось как «совокупность функций и характеристик продукта или услуги, которые влияют на их способность удовлетворять данные потребности» [Американское общество качества, ASQ], «пригодность для использования» [Джуран], «соответствие требованиям. »[Кросби, 9] и« удовлетворение потребностей клиентов »[Деминг]. Все эти определения сфокусировали внимание на «использовании по назначению» и необходимости понимать требования потребителя для обеспечения надлежащего качества.

В это время удовлетворение требований заказчика зависело от первоначальной проверки эффективности метода, затем применялся контроль качества для мониторинга производительности, доступной для метода. Хотя мы разработали протоколы валидации методов и критерии для оценки производительности в отношении требований к качеству в форме «допустимой общей ошибки» (TEa) [10-11], процедуры SQC не были оптимизированы для качества, необходимого для теста, и точность и систематическая ошибка, наблюдаемая для метода. Мы впервые изложили общую методологию для этого в 1986 году в книге «Экономически эффективный контроль качества», в которой принципы TQM применялись к практике в медицинской лаборатории [12].

К 90-м годам появились высокостабильные, высокоточные и высокопроизводительные анализаторы произвольного доступа, такие как серия Hitachi. В дополнение к адаптации контроля качества к аналитической системе стало очевидно, что разные процедуры контроля качества (правила, N) подходят для разных тестов, выполняемых в одной и той же системе. Принципы TQM помогли нам оптимизировать выполнение процедур контроля качества на основе качества, необходимого для предполагаемого использования теста, а также точности и систематической ошибки, наблюдаемых для конкретного метода [13].Повышенная пропускная способность за счет уменьшения количества ложных отбраковок продемонстрировала экономическую эффективность оптимизированных конструкций контроля качества [14].

Шесть сигм и контроль качества 5-го поколения

Сильный толчок к усовершенствованию дизайна QC был обеспечен системой управления качеством Six Sigma, которая была внедрена в промышленности в 90-х годах и вошла в практику в медицинских организациях и лабораториях к концу десятилетия [15]. Шесть сигм подчеркнули необходимость определения «пределов допуска» для описания предполагаемого использования, поставили цель «6 сигм» для «качества мирового класса» и предоставили единообразный способ описания качества с точки зрения дефектов, количества дефектов, дефектов на миллион ( DPM) и сама сигма-шкала.«Инструмент выбора сигма-метрического контроля качества» легко развился из более раннего инструмента «критической ошибки» и в конечном итоге был включен в руководство CLSI C24A3 для «Статистического контроля качества количественных измерений» [16]. Таким образом, стандартные инструменты планирования контроля качества стали доступны в виде ручных инструментов, а также компьютерных программ.

В это время Парвин работал над улучшением дизайна контроля качества, особенно учитывая частоту контроля качества [17]. Он продемонстрировал необходимость структурировать КК вокруг известных и неизвестных событий.Известные события относятся к изменениям, которые происходят в процессе измерения, которые известны на момент их возникновения, например, замена флакона с реагентом, обслуживание анализатора, замена механической части и т. Д. Следует запланировать пробы контроля качества для таких известных событий, а также некоторые образцы следует регулярно анализировать между событиями, чтобы обнаружить неизвестные изменения, которые могут произойти. Рассмотрение практики непрерывной отчетности о результатах тестирования (по сравнению с отчетностью по партиям) также требует постоянного мониторинга процесса с элементами управления.Таким образом, появилась стратегия многоступенчатого контроля качества для контроля качества 5-го поколения, в которой различные схемы контроля качества использовались в разное время в ходе рутинной операции аналитического процесса [18]. Одна из рекомендуемых стратегий заключалась в использовании процедуры контроля качества «При запуске» с высоким уровнем обнаружения ошибок в начале цикла, затем схемы «Монитор» с низким уровнем ложного отклонения на протяжении всего цикла и, наконец, добавление контроля качества данных пациента, например алгоритмы среднего от нормальных значений. (AoN) для измерения длины пробега [19].

Соответствие качества CLIA и «эквивалентный контроль качества»

В 1988 г. вступили в силу поправки о совершенствовании клинических лабораторий (CLIA), за которыми в 1992 г. последовали правила и положения CLIA для реализации этого закона. За исключением того, что одна часть закона, требующая от FDA «очищать» рекомендации или инструкции производителя по контролю качества, была отложена, следовательно, закон CLIA предусматривал временный минимальный стандарт для анализа как минимум двух уровней контроля качества за цикл или двух уровней каждые 24 часа. Этот временный минимальный QC продлевался примерно каждые 2-3 года до 2003 года, когда положение о разрешении QC было отменено в Заключительном, Финальном, Финальном, Финальном, Заключительном Правиле CLIA [20].К тому времени минимальный контроль качества в 2 уровня в день стал фактическим стандартом практики, отбросив продвижение практики контроля качества к однократному контролю качества Леви-Дженнингса 1-го поколения во многих лабораториях.

В 90-х годах стали популярны POC-устройства, и CMS испытывала трудности с обеспечением соблюдения хотя бы двух уровней в день. Производители утверждали, что встроенных средств контроля должно быть достаточно, и CMS временно разрешила «электронный контроль качества» заменить использование средств контроля жидкости в таких устройствах до тех пор, пока не будет введено положение о допуске контроля качества.Электронный контроль качества не был чем-то новым! Подобные инструментальные проверки использовались в течение многих лет, но никогда не заменяли независимую суррогатную контрольную выборку. Например, DuPont ACA использовала ежедневную процедуру «балансировки фильтров», которая представляла собой электрическую проверку, которая предшествовала стандартному анализу образцов пациентов и контрольных материалов. Однако трудности реализации SQC во многих приложениях POC привели к зависимости, прежде всего, от встроенных средств контроля производителя.

Учитывая, что допуск QC не был реализован в Заключительном, Заключительном, Заключительном, Заключительном, Окончательном правиле, CMS предложила новое средство защиты приложений POC, потребовав от лабораторий выполнять протоколы валидации, чтобы снизить частоту анализа суррогатных контролей с двух уровней. в день до двух уровней в неделю или, возможно, даже до двух уровней в месяц. Это называлось «эквивалентным контролем качества», что удобно, но также сбивало с толку эту новую практику с «электронным контролем качества». CMS опубликовала новые руководящие принципы EQC в Руководстве по эксплуатации штата (SOM) [21] и описала протоколы проверки для квалификации устройства для снижения частоты QC.К сожалению, эти протоколы валидации сами по себе были недействительными, потому что периоды времени были слишком короткими. Например, для устройств со встроенными элементами управления, которые контролируют весь процесс тестирования, протокол призывал к тестированию внешних элементов управления вместе со встроенными элементами управления в течение 10 дней, затем, если не наблюдались выходящие из-под контроля проблемы , частота суррогатного контроля может быть сокращена до одного раза в 30 дней. Очевидно, что 10 дней наблюдаемой стабильной работы не гарантируют, что устройство будет стабильно в течение 30 дней, но оно все же соответствует критериям для ежемесячного EQC.

QC для будущего — 1-го или 6-го поколения?

Проблемы с «Эквивалентным контролем качества» были очевидны как для промышленных, так и для лабораторных пользователей. В марте 2005 г. CLSI провела конференцию «Контроль качества в будущем» [22]. Предопределенным результатом было формирование комитета CLSI для разработки нового руководящего документа для решения проблем, возникающих в результате EQC. Спустя примерно 6 лет мы все еще ждем публикации этого руководства. Предлагаемый документ под названием «Лабораторный контроль качества на основе управления рисками» [23] был опубликован в 2010 году, а окончательная «утвержденная» версия ожидается к концу 2011 года.

Анализ рисков включает систематический обзор аналитического процесса измерения для выявления всех возможных видов отказов. Затем оценивается риск каждого режима отказа на основе его вероятности возникновения, возможности обнаружения, если он произойдет, и серьезности ущерба, если он останется необнаруженным. Идентифицируются режимы отказов с высоким риском, затем разрабатывается стратегия минимизации их вреда путем предотвращения возникновения и / или оптимизации обнаружения (и корректирующих действий, необходимых для восстановления).В медицинской лаборатории основным вариантом снижения риска является улучшение обнаружения, что означает внедрение соответствующих механизмов контроля для каждого режима отказа с высоким риском. Эти механизмы управления собраны в «Плане контроля качества», который предписывает их работу, частоту и корректирующие действия, которые необходимо предпринять для восстановления. «Остаточный риск» плана контроля качества необходимо оценить, чтобы определить его приемлемость для предполагаемого использования лабораторного теста. После реализации плана необходимо контролировать качество и производительность процесса тестирования, чтобы выявить сбои, требующие улучшений.

Инструмент для выполнения анализа рисков называется FMEA (анализ видов и последствий отказов), который давно используется в промышленности, но является совершенно новым в медицинских лабораториях. Следовательно, потребуется крутая кривая обучения, если анализ рисков обеспечит надежный подход к разработке планов контроля качества лабораторий. Текущие руководства ISO и CLSI описывают качественные методологии с произвольными решениями о допустимости остаточных рисков. Более количественная методология возможна за счет интеграции концепций и показателей «Шесть сигм» [24], но это делает процесс анализа рисков еще более требовательным и в основном подходит для лабораторий, выполняющих тесты средней и высокой сложности, а не для устройств POC, которые предназначались для использования. EQC и мотивация для разработки руководства по контролю качества управления рисками CLSI [23].

Анализ рисков вряд ли заменит EQC, если CMS не исключит варианты EQC в Руководстве по эксплуатации штата. Время и усилия для валидации EQC намного меньше, чем то, что потребуется для выполнения анализа рисков, поэтому реальные преимущества анализа рисков будут для сложных аналитических систем, где разработка подробного плана QC необходима для адекватного мониторинга критических режимов отказа. . Это может быть выгодно производителям, которые хотят задокументировать уместность подходов «альтернативного контроля качества», и лабораториям, которым необходимо предоставить комплексные планы контроля качества для лабораторных испытаний (LDT).Это будет способствовать более полному мониторингу преаналитических и постаналитических режимов отказов в рамках рутинного контроля качества. Внедрение будет поддерживаться программным обеспечением автоматической проверки, но будет критически важно убедиться, что SQC по-прежнему является частью внедряемых правил автоматической проверки.

Что делать?

Если текущие варианты EQC сохранятся, то мы вернемся к исходной точке — QC 1-го поколения — для тех лабораторий, которые руководствуются правилами соответствия! Если комплексные планы контроля качества будут правильно разработаны, они приведут к улучшениям и контролю качества 6-го поколения! Такое продвижение необходимо для современных очень сложных автоматизированных аналитических систем, а также для новых сложных измерительных технологий, где традиционные процедуры SQC необходимо дополнять, чтобы обеспечить всесторонний мониторинг преаналитических, аналитических и постаналитических режимов отказов.

Мы находимся на развилке дорог, и у нас есть выбор ехать по большой дороге или по низкой дороге. Преодоление соблюдения требований качества в последнее десятилетие теперь может стать серьезной проблемой в продвижении вперед с улучшенными системами качества как для производителей, так и для медицинских лабораторий. Анализ рисков предлагает новый подход к совершенствованию систем качества, но это также подход, которым можно легко злоупотребить и использовать неправильно, чтобы обеспечить лишь видимость системы качества. Проблемы с анализом рисков на Уолл-стрит и с глубоководными нефтяными скважинами должны быть свежими в наших умах и дать нам понять, что анализ рисков сам по себе является рискованным делом.

Список литературы

  1. Shewhart WA. Экономический контроль качества выпускаемой продукции. Нью-Йорк: D Van Nostrand Company, 1931.
  2. Деминг WE. Качество, производительность и конкурентоспособность. Бостон: Центр перспективных инженерных исследований Массачусетского технологического института, 1982 г.
  3. Juran JM. Управленческий прорыв. Нью-Йорк: McGraw-Hill Book Co, 1964.
  4. Леви С., Дженнингс ER. Использование контрольных карт в клинической лаборатории. Дж. Клин Патол 1950; 20: 1059-66.
  5. Генри Р.Дж., Сегалов М. Выполнение стандартов в клинической химии и использование контрольной таблицы. Дж. Клин Патол 1952; 27: 493-501.
  6. Льюис Л.А. Леонард Такер Скеггс — многогранный бриллиант. Clin Chem 1981; 27: 1465-68.
  7. Westgard JO, Groth T, Aronsson T, Falk H, deVerdier C-H. Характеристики эффективности правил внутреннего контроля качества: вероятность ложного отклонения и обнаружения ошибок. Clin Chem 1977; 23: 1857-67.
  8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T.Диаграмма Шухарта с множеством правил для контроля качества в клинической химии. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
  9. Crosby PB. Качество бесплатно. Нью-Йорк: New American Press, 1979.
  10. Westgard JO, Hunt MR. Использование и интерпретация статистических тестов в сравнительных исследованиях методов. Clin Chem 1973; 19: 49-57.
  11. Westgard JO, Carey RN, Wold S. Критерии оценки точности и аккуратности при разработке и оценке методов. Clin Chem 1974; 20: 825-33.
  12. Westgard JO, Barry PL.Экономически эффективный контроль качества: управление качеством и производительностью аналитических процессов. Вашингтон, округ Колумбия: AACC Press, 1986.
  13. Koch DD, Oryall JJ, Quam EF, Feldbruegge DH, Dowd DE, Barry PL, Westgard JO. Выбор полезных с медицинской точки зрения процедур контроля качества для отдельных тестов в мульти-тестовой аналитической системе. Clin Chem 1990; 36: 230-3.
  14. Westgard JO, Oryall JJ, Koch DD. Прогнозирование влияния практик контроля качества на рентабельную работу мультиитестовой аналитической системы.Clin Chem1990; 36: 1760-4.
  15. Westgard JO. Дизайн и контроль качества «Шесть сигм»: желаемая точность и необходимый контроль качества для лабораторных процессов измерения. Мэдисон, Висконсин: Вестгард, королевский адвокат, 2001.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.